T1 = 50°C pH1 = 4,8 T2 = 34°C pH2 = 4,8 INIBIÇÃO ? + Fermentação Hidólise Enzimática Celulose Etanol Celulase (endoglucanases e exoglucanases) Celobiose Beta glucosidase Glicose T = 38°C pH = 4,8 Hidólise Enzimática Fermentação Celulose Etanol Glicose 21
Figura 9 Comparação entre hidrólise SHF e SSF.
Segundo SANTOS et al, 2010, nos processos em SSF com pré sacarificação a conversão enzimática após 16 horas foi muito próxima àquela obtida em período semelhante no processo em SHF, sendo relatado que no processo SSF foi utilizada uma menor quantidade de enzima (dado não apresentado pelos autores).
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A fermentação alcoólica é um processo biológico no qual compostos orgânicos, como açúcares, são convertidos por microorganismos em componentes mais simples. No caso da fermentação alcoólica, esses componentes mais simples seriam o etanol e o CO2. Historicamente, o microorganismo mais comumente utilizado neste processo, tem sido as leveduras, dentre elas a Sacaromyces cerevisiae tem se destacado.
Como nos processos anteriores, existem diversas configurações para se realizar a fermentação dos hidrolisados de materiais lignocelulósicos, tanto se tratando na configuração do sistema (batelada, CSTR, dentre outras) como também
do microrganismo utilizado, que pode ser levedura, bactérias ou fungos. O ideal na etapa de fermentação seria a utilização de reatores bateladas com leveduras S. cerevisae, já que o sistema para produção de álcool no Brasil trabalha desta maneira, e assim, uma adaptação para este processo seria mais simples. Foi citado por OLSSON et al. 1996 que os dois principais problemas para o processo de fermentação de materiais lignocelulósicos são:
Primeiro, depois do pré tratamento, o material hidrolisado contém não somente açúcares fermentecíveis, mas também muitos componentes que apresentam efeito inibidor para os microorganismos utilizados na fermentação;
Segundo, a hemicelulose hidrolizada contém não somente hexoses mas também pentoses. Hexoses podem ser fácilmente fermentadas como é já realizada no processo de primeira geração por Sacaromyces cerevisiae. As pentoses, porém, são mais difíceis para fermentar.
Segundo KRISTENSEN et al., 2009 trabalhar com concentrações de sólidos alta na hidrólise enzimática para conversão de celulose é uma vantagem pois aumenta se a concentração do produto e a produtividade da planta enquanto diminui se o gasto com água e energia no processo.
Em paralelo com estudos que vem sendo desenvolvidos para a fermentação de pentoses, hidrólises com alta carga de sólidos, dentre outros estudos, devemos considerar tudo como parte integrante de um processo que pode ser realizado até mesmo com o processo já existente de primeira geração. Para isso, deve se levar em conta a integração de energia, a recuperação de enzimas, recirculação de água no processo dentre outros rearranjos, como por exemplo, proceder a hidrólise e fermentação de forma simultânea (SSF) diminuindo riscos de contaminação, dentre outras muitas alternativas existentes. A Figura 10 mostra um esquema do processo de produção de etanol com bagaço proposto por OLSSON, 1996.
Figura 10 Fluxograma proposto por OLSSON, 1996 para produção de etanol celulósico.
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Uma visão geral do histórico do setor sucro álcooleiro no Brasil, seu impacto na econômia do país e a sua contribuição com relação ao meio ambiente comparado com combustíveis fosséis são apresentados a seguir.
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No Brasil, as indústrias de açúcar e de álcool estiveram sempre intimamente ligadas, desde o tempo do descobrimento. A produção de etanol iniciou se na capitania de São Vicente, porque nela foi montado o primeiro engenho de açúcar do país, após a vinda das primeiras mudas de cana de açúcar, trazidas da ilha da madeira em 1593.
Se verificarmos a matriz energética brasileira atual (Figura 11) observa se que o Brasil possui uma posição privilegiada com mais de 45% de seus recursos constituídos de energia renovável.
Figura 11 – Matriz energética brasileira Fonte: MME, 2010
Dentre os tipos de energia utilizados no Brasil, destaca se a energia hidráulica e a de produtos da cana de açúcar, mas especificamente o etanol usado nos motores de veículos.
Este cenário se deve muito a estratégia brasileira adotada na década de 70 com a tentativa de diminuir a dependência do petróleo, pois este estava com preços altíssimos. O Pró alcool foi o programa criado para incentivar a indústria da cana a produzir etanol. Desde então, a produção de álcool assumiu um importante patamar na matriz energética brasileira.
Segundo PELLEGRINI, 2009 o programa do Pró álcool pode ser dividido em três importantes fases para a indústria sucroálcooleira:
• de 1975 a 1979: chamada de “expansão moderada”, marcada pelo aumento de produção do álcool anidro, via capacidade ociosa existente (destilarias anexas), baixa adesão da indústria automobilística e alta concentração de recursos públicos para o financiamento do programa;
• de 1980 a 1985: foi a “expansão acelerada”, marcada pela expansão da produção de álcool hidratado a partir de destilarias autônomas e um aumento substâncial da produção/venda de carros a álcool;
• de 1986 a 1995: “desaceleração e crise”, marcada pela diminuição dos preços do petróleo no mercado internacional, aumento da produção nacional de petróleo, fim dos incentivos estatais, crise de abastecimento e retração do mercado.
Em 2001 presenciamos o chamado “apagão” com o objetivo de racionamento de energia elétrica no país; o governo iniciou então um programa de incentivo para fontes alternativas de geração de eletricidade (biomassa, eólica, etc).
Os carros flex fuel em 2003, o aumento nos preços de barris de petróleo, e uma nova consciência com relação ao meio ambiente, faz com que a busca pelo etanol se tornasse maior ainda a partir de então, proporcionando, assim, um aumento da competitividade dentro do setor, um melhoramento de eficiência no processo de produção e a aquisição de novas estratégias para diferenciação de produtos.
Por este breve histórico percebe se uma grande evolução na agroindústria brasileira que passou a produzir não somente um único produto (o açúcar) mas diversos outros. Esta complexa indústria com diversos produtos e possibilidades marca uma nova definição da indústria de açúcar e álcool, a de biorefinaria.
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A cana de açúcar é a segunda maior fonte de energia renovável do Brasil, com 14,6% de participação na matriz energética atual, considerando se o álcool combustível e a co geração de eletricidade, a partir do bagaço. Dos 6 milhões de hectares, cerca de 85% da cana de açúcar produzida no Brasil está na Região Centro Sul (concentrada em São Paulo, com 60% da produção) e os 15% restantes na Região Norte Nordeste.
A Figura 12 representa a produção de etanol total no Brasil ao decorrer dos anos.
Figura 12 Produção de etanol no Brasil Fonte: ANP, 2010.
O aumento de vendas de carros movidos a álcool e o aumento nos preços do barril de petróleo contribui para que cada vez mais se aumentasse a produção de etanol no Brasil e no mundo.
Em 1988, perto de 30% da frota automotiva brasileira rodou com etanol hidratado, enquanto que, atualmente, toda a frota brasileira utiliza ou o etanol hidratado (95 96%) ou uma mistura de até 26% de etanol na gasolina (RAMOS, 2000).
A Figura 13 mostra a evolução no preço do petróleo ao longo dos anos, outro fator que contribui para o aumento na produção e uso do etanol.
Figura 13 – Evolução do preço do barril de petróleo (em dólar/barril) ao longo dos anos.
Fonte: ANP, 2011.
O fato de o Brasil possuir um papel importante no cenário mundial de produção de etanol se deve em grande parte a política do Pro álcool instalada no Brasil no ínicio da década de setenta. O Pro álcool forneceu subsídios para a implantação de unidades produtoras de álcool pelas indústrias açucareiras com pequenos investimentos de seus proprietários. Com este programa, o governo tentava diminuir sua vulnerabilidade diante das oscilações de petróleo devido à crise internacional de 1973, produzindo um combustível alternativo a gasolina, oriundo da cana.
Podemos notar a evolução do preço (em reais) do litro de etanol e gasolina no Brasil no período de 2001 a 2010 na Figura 14.
Figura 14 Preço do etanol e da gasolina no Brasil Fonte: ANP, 2010.
O etanol, ao longo dos anos, através de incentivos e melhoria no rendimento das usinas atinge preços cada vez mais competitivos no mercado com relação à gasolina.
Devido a competitividade do preço do etanol em relação à gasolina, a maior parte das vendas de carros hoje no Brasil é de modelos flex fuel, os quais podem se locomover tanto com álcool como com gasolina (Figura 15).
Figura 15 Fabricação de automóveis no Brasil
Fonte: Associação Nacional dos Fabricantes de Veículos Automotores Brasil / ANFAVEA, 2011.
Além de toda importancia econômica, o etanol também traz muitos benefícios relacionados com o meio ambiente. Estes benefícios são discutidos de forma sintetizada no item a seguir.
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Outro fator de grande importância a ser levado em consideração nas buscas de novas tecnologias e pesquisas na área de biocombustíveis é o fato da contribuição para o meio ambiente que esses tipos de energias renováveis proporcionam.
Apesar de existir poucos estudos que relacionam emissões de poluentes com energias adicionadas no processo de produção (combustíveis fósseis), pode se dizer que a produção de etanol no Brasil faz um excelente uso da biomassa. Combustíveis fósseis adicionados no processo são baixos comparados com a produção de etanol nos EUA e Europa.
Alguns trabalhos mostram que para cada unidade de etanol produzida no Brasil, somente 0,1 unidade de energia fóssil é requerida, bem menor que 0,6 a 0,8 requeridas para produzir uma unidade de etanol nos EUA e Europa respectiviamente
(IEA, 2004). A Tabela 1 mostra o balanço de energia na produção de etanol a partir de diferentes matérias primas.
Tabela 1. Balanço de energia na produção de etanol com diferentes materias primas Fonte: MACEDO, 2007
Outra grande vantagem do uso de biocombustíveis é o reaproveitamento de resíduos agrícolas, usados na sua produção, sem a necessidade de aumento de áreas produtivas.
Assim, observando brevemente dados históricos, ecônomicos e ambientais, observa se de forma mais clara a grande importancia do etanol e seu uso como combustível renovável.
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O bagaço de cana de açúcar (BCA) in natura utilizado neste trabalho foi cedido pela Usina Iracema (Iracemápolis, SP). O BCA explodido a vapor (condições da explosão: 17 kgf/cm2, 205°C e 20 minutos) foi cedido pelo Centro de Tecnologia Canavieira (CTC, Piracicaba, SP).
O extrato enzimático (Accelerase 1500) utilizado neste trabalho foi doado pela empresa GENENCOR (EUA).
Na etapa de fermentação foi utilizada levedura Saccharomyces cerevisiae (levedura comercial na forma liofilizada, marca Fleishmann).
Os demais reagentes de laboratório utilizados neste trabalho foram adquiridos em grau analítico e não sofreram qualquer tratamento antes de sua utilização.
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Em frasco Erlenmeyer ou balão de vidro foi colocada uma amostra de BCA in natura ou BCA explodido e água ou solução de ácido sulfúrico (H2SO4) 1% (m/v) na
proporção de 1:20 (massa de sólido em base seca para massa de solução). Esta suspensão foi submetida à autoclavagem (120°C) por 30 minutos.
Após autoclavagem, o resíduo sólido foi filtrado. A fração sólida resultante foi então submetida a sucessivas lavagens com água na temperatura de 50 oC para remoção da hemicelulose solubilizado e neutralização. Ao final o material sólido foi filtrado e sua umidade determinada.
Em algumas sequências de pré tratamento este material foi transferido para frasco Erlenmeyer ou balão de vidro. Adicionou se solução de NaOH (4% ou 7%, m/m) na mesma proporção líquido sólido já descrita. Procedeu se a etapa de deslignificação do material por meio de nova autoclavagem (120 °C por 30 minutos). Ao final, o resíduo sólido foi lavado abundantemente com água quente até que o filtrado não mais apresentasse coloração amarelada no efluente da lavagem e o pH
atingisse valor neutro. Este sólido foi submetido à última lavagem com tampão citrato de sódio (pH=4,8) e filtrado em seguida, tendo ao final sua massa e umidade determinadas. Este material passou a ser denominado de BCA pré tratado. O material foi armazenado em geladeira até sua utilização nos experimentos de hidrólise.
Em uma das seqüências de pré tratamento realizou se apenas a autoclavagem (120oC) por 30 minutos do BCA in natura com solução de NaOH 7% (a primeira autoclavagem com água ou solução de ácido sulfúrico não foi realizada).
A Figura 16 apresenta fotografia com frascos Erlenmeyer e balões de vidro contendo os materiais após a segunda autoclavagem.
Figura 16 Fotografia dos frascos Erlenmeyer e balão de vidro ao final da etapa de pré tratamento (etapa de deslignificação) das amostras de BCA in natura e
explodido (deslignificação com solução de NaOH).
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Amostras de BCA in natura ou explodido a vapor foram adicionadas a uma autoclave de aço inoxidável cilíndrica (volume útil de aproximadamente 200 cm3, Figura 17) com solução de hidróxido de amônio 15% (m/m) na proporção de 1:5 (massa de sólido para massa de solução). A autoclave foi fechada e imersa em um
recipiente com água em ebulição por período de uma hora. Em seguida, após o resfriamento do equipamento em banho de gelo, o material contido em seu interior foi lavado com água quente até que o filtrado não mais apresentasse coloração amarelada no efluente da lavagem e o pH atingisse valor neutro. A última lavagem foi realizada com tampão citrato de sódio (pH=4,8). O material foi filtrado e sua umidade determinada. O material foi armazenado em geladeira para ser utilizado nos experimentos de hidrólise.
Figura 17 Fotografia do reator cilíndrico de aço inoxidável (autoclave) utilizado nos experimentos de pré tratamento do BCA empregando solução de NH4OH (Silva,
2011).
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A umidade das amostras de BCA foi determinada empregando determinador de umidade modelo ID50 (Marte Balanças e Aparelhos de Precisão Ltda) a 100°C em modo automático.
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Os rendimentos mássicos das etapas de pré tratamento avaliadas neste trabalho foram calculados utilizando a equação (1).
⋅ = (1) onde:
minicial massa inicial seca de material lignocelulósico (g);
mfinal massa final seca de material lignocelulósico (g);
R rendimento mássico.
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As amostras de BCA foram caracterizadas utilizando se metodologia para caracterização química de bagaço de cana de açúcar descrita por GOUVEIA et al., 2009. A fração líquida oriunda da etapa de caracterização foi analisada por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Cada etapa deste processo de caracterização é descrita nos próximos itens.
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Amostras de 2 gramas de BCA (in natura, explodido a vapor e pré tratado) com 10% de umidade (cominuídas a 20 mesh em moinho de facas) foram transferidas para béqueres de 100 mL e misturadas a 10 mL de solução de ácido sulfúrico 72% em banho termostatizado (Nova Ética) a 45°C por 7 minutos, sob vigorosa agitação. Em seguida as amostras foram transferidas quantitativamente para frascos Erlenmeyers de 500 mL, adicionando se 275 mL de água destilada. Os frascos Erlenmeyers foram fechados com papel alumínio e autoclavados por 30 minutos a 120°C.
Após a autoclavagem, aguardou se o resfriamento do material a temperatura ambiente. Em seguida realizou se a filtração separando a parte sólida da líquida em papel de filtro qualitativo. A fração líquida foi transferida para balão volumétrico de 500 mL, o qual teve o seu volume completado com água destilada. A solução foi
armazenada para análises posteriores de carboidratos, ácidos orgânicos, furfural, hidroximetil furfural (HMF) e lignina solúvel.
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O material retido no papel de filtro foi lavado com 1500 mL de água destilada, transferido para pesa filtros para secagem em estufa a 100 °C até massa constante. A percentagem de lignina insolúvel foi calculada em relação à massa de amostra seca (Equação 2). ⋅ − = (2) onde:
LK Lignina Klason insolúvel;
MK Massa de lignina insolúvel seca;
MC Massa de cinzas;
MA Massa da amostra seca.
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A quantidade de lignina solúvel foi determinada pela medida da absorbância a 280 nm em espectrofotômetro (Pharmacia Biotech Ultrospec 2000). O cálculo da lignina solúvel foi determinado conforme a equação 3.
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)
−− ⋅ − − ⋅
⋅
= (3)
onde:
Clig concentração de lignina solúvel, em g/L;
AT absorbância da solução de lignina junto com os produtos de degradação, em
280 nm;
Apd= (c1ε1+ c2ε2) absorbância dos produtos de degradação, em 280 nm,
dos produtos de decomposição dos açúcares (furfural e hidroximetilfurfural, respectivamente), cujas concentrações c1 e c2 foram determinadas previamente por
CLAE (cromatografia líquida de alta eficiência) e ε1 e ε2 são as absortividades e
valem, respectivamente, 146,85 e 114,00 L g1cm1.
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A fração líquida das amostras foi analisada por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Nas análises de carboidratos e ácidos orgânicos foi utilizada coluna Aminex HPX87H (300 x 7,8 mm, Bio Rad Laboratories Ltd) em cromatógrafo Shimadzu modelo LC 10AD, empregando um detector de índice de refração Shimadzu modelo RID 6A. A fase móvel utilizada consistia de solução de ácido sulfúrico 5 mM. A temperatura do forno foi mantida em 45°C. A vazão do eluente foi de 0,6 mL⋅min1
. Na determinação de furfural e hidroximetilfurfural utilizou se coluna i Bondapack C 18 (5 im) de 125 x 4 mm (Hewlett Packard), empregando como fase móvel solução de acetronitrila com água na proporção de 1:8 e 1% de ácido acético. A vazão empregada foi de 0,8 mL⋅min1. A temperatura do forno foi mantida a 25°C.
Os compostos foram detectados em 276 nm por um detector UV visível Shimadzu SPD 10.
As concentrações de carboidratos, ácidos orgânicos, hidroximetilfurfural e furfural foram quantificadas a partir de curvas de calibração de cada composto puro (padrões).
Os compostos detectados nesta análise foram:
• glicose, ácido fórmico, celobiose, hidroximetilfurfural (provenientes da fração hidrolisada de celulose).
• xilose, arabinose, ácido glucorônico, ácido acético e furfural (provenientes da fração de hemicelulose).
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O filtro de papel utilizado na determinação da lignina insolúvel em meio ácido, junto com a amostra já seca, foi transferido para um cadinho de porcelana,
previamente tarado. A amostra foi calcinada à 300 °C por uma hora e mais duas horas a 800°C, em uma mufla (modelo 318D24, Quimis). Após resfriamento o cadinho foi pesado e a porcentagem de cinzas na amostra determinada (equação 4).
⋅ = (4) onde:
% cinzas Percentual em massa de cinzas;
MC Massa de cinzas;
MA Massa da amostra em base seca.
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Nos experimentos de hidrólise enzimática e fermentação alcoólica a concentração de glicose foi determinada por método colorimétrico empregando kit enzimático (marca Doles Reagentes). Neste método, 10 microlitros da amostra foram adicionados a 1 mL da solução do kit enzimático. Esta solução foi submetida à 37°C em banho termostatizado por cinco minutos. A absorbância das soluções foi lida em espectrofotômetro a 510 nm.
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Nos experimentos de fermentação alcoólica as concentrações de glicose e etanol ao longo do processo foram quantificadas por cromatografia líquida de alta eficiência. Foi utilizada coluna Aminex HPX87H (300 x 7,8mm, Bio Rad Tecnologies Ltd) em cromatógrafo Shimadzu modelo LC 10AD, empregando detector de índice de refração Shimadzu modelo RID 6A. Fase móvel utilizada: ácido sulfúrico 5 mM, temperatura do forno mantida a 45°C e vazão de eluente de 0,6 mL⋅min1.
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Algumas amostras de BCA foram submetidas à caracterização estrutural por microscopia eletrônica de varredura (MEV).
As análises de MEV foram realizadas no Instituto de Química de São Carlos (IQSC, USP, São Carlos, SP) em equipamento LEO (modelo 440) com detector OXFORD, operando com feixe de elétrons de 20 kV. As amostras foram recobertas com 10nm de ouro em um metalizador Coating System BAL TEC MED 020 e mantidas em dessecador até o momento de análise. Algumas análises foram realizadas no Laboratório de Caracterização Estrutural (LCE DeMA, UFSCar, São Carlos, SP).
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Amostras de diferentes seqüências de pré tratamento foram submetidas a experimentos de hidrólise enzimática na configuração SHF (Separated Hydrolysis and Fermentation) em reatores de vidro encamisados (volume útil de 100 mL), a temperatura de 50°C e sob agitação mecânica de 150 rpm.
Na etapa 1 a carga de sólidos utilizada foi de 8% (m/v). Nas etapas 2 e 3 as cargas de sólidos utilizadas foram de 10% e 12% (m/v). Na etapa 4 a carga de sólidos foi elevada para 15% e 20% (m/v). Os meios de hidrólises tinham em sua composição: bagaço pré tratado (calculado em base seca para a carga de sólidos avaliada), extrato enzimático nas proporções avaliadas (33, 65 e 98 FPU/g celulose) e tampão citrato de sódio (q.s.p). A Figura 18 apresenta uma fotografia do reator no qual os experimentos de hidrólise enzimática foram realizados (etapas 1, 2 e 3). A Figura 19 mostra o equipamento utilizado nos experimentos de hidrólise realizados na etapa 4.
Figura 18 Fotografia do reator utilizado nos experimentos de hidrólise enzimática na configuração SHF (Separated Hydrolysis and Fermentation) nas etapas 1, 2 e 3.
Figura 19 Fotografia do reator utilizado nos experimentos de hidrólise enzimática na configuração SHF (Separated Hydrolysis and Fermentation) na etapa 4.
O meio reacional para os experimentos realizados na configuração SSF (Simultaneous Saccharification and Fermentation) era composto dos mesmos
constituintes utilizado na configuração SHF e adicionando se a ele os componentes do meio de fermentação descritos no item 3.7.
Todos experimentos de hidrólise enzimática foram realizados utilizando o extrato enzimático Accelerase 1500 da Genencor, vale observar que este extrato apresenta uma atividade celobiolítica alta, não havendo necessidade de complementação com beta glucosidase.
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A quantificação de proteína no extrato enzimático (Accelerase 1500) e no sobrenadante do experimento de hidrólise enzimática foi efetuada de acordo com o método de Bradford (1976).
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Para a determinação da atividade enzimática no extrato fornecido pela Genencor, utilizou se da metodologia de determinação da atividade enzimática de celulase total (GHOSE, 1987).
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As fermentações foram realizadas em frascos Erlenmeyers ou em tubos falcon mantidos a 32°C em incubadora (New Brunswick Scientific, C25KC, incubator shaker) sob agitação de 150 rpm. O meio reacional dos experimentos de