Staphylococcus aureus resistentes a meticilina (MRSA)

Os antimicrobianos podem variar quanto à sua estrutura química e mecanismo de ação, espectro de atividade pertencendo a grupos diferentes. No grupo dos β-lactâmicos, encontram-se os antimicrobianos representados pelas penicilinas naturais e sintéticas, as cefalosporinas, carbapenemas e monobactans. Os β-lactâmicos são antimicrobianos que têm como principais alvos de ação as enzimas que atuam nas etapas finais da formação da parede celular bacteriana. Essas enzimas, são proteínas de membrana que por se ligarem aos antimicrobianos β-lactâmicos, são chamadas de proteínas de ligação à penicilina (PBP; penicillin binding protein). A ligação do β-lactâmico às PBPs impede que estas exerçam sua atividade de transpeptidase, endopeptidase e glicoxidase, levando à alteração na formação da camada de peptidoglicano da parede celular, o que parece desencadear a morte bacteriana por um processo ainda pouco conhecido (MURRAY, 2003).

São descritos dois mecanismos principais pelos quais pode ocorrer resistência bacteriana aos β-lactâmicos. Um deles é através da produção de β-lactamases. As β-lactamases são enzimas produzidas pela bactéria, capazes de degradar os β-lactâmicos. A produção desta enzima é responsável pelo aparecimento das primeiras resistências à penicilina (CHAMBERS, 1997). Este fato levou ao desenvolvimento de penicilinas resistentes às β-lactamases, como alternativa ao tratamento das doenças infecciosas. No caso das infecções estafilocócicas, a oxacilina e a meticilina, passaram a ser antimicrobianos de primeira escolha no tratamento das enfermidades causadas por estas bactérias (LOWY, 2003). O outro mecanismo de resistência é através da alteração da proteína PBPs (LOWY, 2003). Os estafilococos produzem quatro tipos de PBPs, denominadas PBP1 a 4. As cepas resistentes expressam o subtipo denominado PBP2a ou PBP2’ (KATAYAMA et al., 2000).

Nos anos 50 foi introduzido o antimicrobiano meticilina, primeira penicilina semisintética anti-estafilocócica utilizada no tratamento de todas as infecções por S. aureus produtores de penicinilase. Entretanto, a resistência a meticilina foi reportada muito precocemente, logo após sua introdução, em 1961 (JEVONS, 1961). Tal processo ocorre devido à aquisição cromossômica do gene, denominado mecA, que codifica para a produção de uma PBP alterada definida

como PBP2a (Penicillin Binding Proteins 2a). Esta proteína possui uma baixa afinidade com a molécula do antibiótico, permitindo que as reações na síntese da parede celular bacteriana ocorram. Desta forma ela confere resistência a todos os agentes β-lactâmicos (LOWY, 2003). Durante muitos anos as infecções causadas por MRSA foram documentadas apenas em serviços de saúde, sendo estas cepas denominadas HA-MRSA (healthcare-associated methicillin-resistant S. aureus), recentemente cepas MRSA emergiram associadas à comunidade CA- MRSA (community-associated methicillin-resistant S. aureus) (CHAMBERS, 2001). CA-MRSA tende a provocar doença principalmente em pacientes jovens sadios, estando associado predominantemente a infecções de pele. HA-MRSA tem sido isolado a partir de indivíduos mais velhos, hospitalizados ou expostos a ambientes hospitalar e que apresentam algum tipo de comorbidade, causando principalmente pneumonia, bacteremia ou infecções invasivas (DAVID e DAUM, 2010). Atualmente não há uma definição única e globalmente adotada, que identifique com precisão um isolado como CA-MRSA. Algumas definições têm sido propostas, baseadas em informações epidemiológicas e clínicas; e/ou por técnicas laboratoriais de biologia molecular (KLUYTMANS et al., 2006; SHOPSIN et al., 2003). De acordo com o critério do CDC, infecções causadas por CA-MRSA são definidas quando algum isolado MRSA é coletado de um paciente em ambiente ambulatorial ou diagnosticado por cultura do material clínico de um paciente com até 48h de hospitalização e sem história de infecção ou colonização anterior por MRSA, sem internação ou procedimento cirúrgico no último ano, sem admissão em casas de saúde, hospício, lar de idosos, serviços especializados de enfermagem, que não faz ou fez uso de diálise ou ainda de cateteres ou dispositivos intravenosos que passam através da pele para dentro do corpo (RYBAK e La PLANTE, 2005). Em contraste com as cepas HA-MRSA, as cepas CA-MRSA são geralmente sensíveis à maioria das classes de antimicrobianos, exceto aos β-lactâmicos (WANNET et al., 2005). Uma característica que pode ser observada nas cepas CA-MRSA é a presença da toxina Panton-Valentine leucocidina (PVL). Esta citotoxina é capaz de destruir leucócitos humanos e infligir grave dano tecidual, estando relacionada com lesões necróticas de pele e grave pneumonia necrotizante, geralmente associada a uma alta letalidade (PALAVECINO, 2004). A citotoxina PVL é considerada um marcador molecular

associado a CA-MRSA (VANDENESCH et al., 2003). No entanto, dados indicam que PVL não está sempre presente entre as cepas CA-MRSA (TEIXEIRA et al., 1995; CARVALHO et al., 2012).

Os termos HA-MRSA, CA-MRSA e LA-MRSA, são utilizados para destacar as diferenças genotípicas, epidemiológicas e características clínicas de certos isolados MRSA (DAVID e DAUM, 2010). CA-MRSA carreia preferencialmente os SCCmec dos tipos IV, V e eventualmente o tipo VII (IWG-SCCmec, 2011). Enquanto HA-MRSA carreia principalmente os tipos I, II, III e evrentualmente o tipo VIII (ZHANG et al., 2005). LA-MRSA carreia os tipos Iv e V. A maioria das cepas LA-MRSA são resistentes a tetraciclina e não são tipificados pelo PFGE com a enzima de restrição SmaI (LI et al., 2011).

MRSA também coloniza e provoca infecções em uma variedade de animais, incluindo de fazenda (pecuária) e alguns selvagens (DOYLE et al., 2012). MRSA do tipo ST398 foi primeiramente identificado em porcos, na Holanda em 2003, sendo denominado MRSA pecuária-associado (LA-MRSA; Livestock- associated MRSA) (ARMAND-LEFEVRE et al., 2005; LOEFFEN et al., 2005). LA- MRSA são geneticamente distintos dos isolados humanos (VANDERHAEGHEN et al., 2010). ST398 também foi isolado de humanos e outros animais de fazenda (CUNY et al., 2010). Pesquisas indicam que suínos, vitelos e frangos são os principais reservatórios para ST398 (ECDC 2009), mas esta cepa também foi encontrada no gado leiteiro e no leite (KREAUSUKON et al., 2012). LA-MRSA estão associados principalmente com o complexo clonal (CC) 398 (van LOO et al., 2007).

A resistência fenotípica à oxacilina é extremamente variável (heterorresistência) e depende da expressão do gene mecA (MARANAM et al., 1997). Na expressão heterogênea de resistência à meticilina, somente uma fração de colônias expressa resistência à oxacilina, apesar da presença do gene mecA, dificultando a interpretação do teste. Desde 2004, o CLSI indica a utilização do disco de cefoxitina (30 μg) para determinação da suscetibilidade a oxacilina em cepas de Staphylococcus, pelo fato deste antimicrobiano ter apresentado uma capacidade de indução da expressão da resistência a meticilina, através do gene mecRI, mais forte e mais eficiente do que a oxacilina (SHARP et al., 2004; POTTUMARTHY et al., 2005). Nos últimos anos, vários autores têm demonstrado

essa eficácia do teste de disco difusão com cefoxitina para o diagnóstico da resistência à oxacilina em estafilococos (VELASCO et al., 2005; MÍMICA et al., 2007; SILVA-CARVALHO et al., 2009).

O gene mecA é um segmento de DNA exógeno de 2,1Kb que está inserido em um elemento genético móvel denominado de cassete cromossômico estafilocóccico mec (SCCmec), localizado em um sítio específico do cromossomo dos estafilococos (attBscc), próximo ao ponto de origem de replicação do DNA flanqueado por sequências diretas e repetidas (KATAYAMA et al., 2000). Este segmento de DNA, variando entre 21 e 67 kb, carreia, além do gene mecA, os genes mecR1 e mecI, que codificam o indutor MecR e a proteína repressora MecI. Outros genes múltiplos de resistência, além da meticilina, também podem ser encontrados (OLIVEIRA et al., 1998). O elemento SCCmec é composto por três elementos genéticos essenciais: o complexo gênico mec, responsável pela resistência; o complexo gênico ccr (cassette chromosome recombinase), que codifica recombinases responsáveis pela sua mobilidade e responsável pela excisão e integração do cassete no genoma bacteriano; e a região J (junkyard) que codifica resistência para antibióticos não β-lactâmicos e metais pesados (HIRAMATSU et al., 2002; ZHANG et al., 2005).

Com base na combinação das classes do gene mec com os alótipos do gene ccr, onze tipos de SCCmec (I a XI) foram descritos (TURLEJ et al., 2011; ZONG et al., 2011; SHORE et al., 2011). No entanto, os tipos SCCmec podem ser diferenciados em subtipos dependendo das variações nas regiões J (HANSSEN e SOLLID, 2005; CHAMBERS e De LEO, 2009; MALACHOWA e De LEO, 2010). Os elementos SCCmec tipo I, II, III, VI e VIII, em geral, estão associados a centros hospitalares. Diferentemente, os tipos IV, V ou VII que têm sido amplamente disseminados entre cepas de CA-MRSA (CHAMBERS e De LEO, 2009). A tipificação do SCCmec é importante para entender a epidemiologia e a relação clonal das cepas MRSA (ZHANG et al., 2005). O tipo I (34,3 Kb) foi identificado na primeira cepa isolada em 1961, no Reino Unido, o tipo II (53 Kb), em uma cepa isolada no Japão em 1982, o tipo III (66,6 Kb) em uma cepa isolada em 1985 na Nova Zelândia. Esses cassetes são caracterizados pela presença de

outros genes de resistência, além do gene mecA, como antibióticos não β-lactâmicos e metais pesados (ITO et al., 2001; OLIVEIRA e LENCASTRE,

2002). Em 2002 foi identificado o SCCmec tipo IV, bem menor que os tipos anteriores (21 a 24,3 Kb), isolado do Clone Pediátrico MRSA adquirido na comunidade e caracterizado por possuir somente o gene mecA (DAUM et al., 2002). Ito et al (2004) identificaram o SCCmec tipo V (28Kb), que também não carreia outros genes de resistência, a não ser o mecA (ITO et al., 2004). Em 2006, foi descrito por Oliveira e colaboradores o SCCmec tipo VI (20,9 Kb), porém, com diferenças na estrutura genômica e alótipos de recombinases, caracterizando origem hospitalar (OLIVEIRA et al., 2006). Em 2008, Berglund e colaboradores, em estudos desenvolvidos utilizando um isolado proveniente de uma mulher sem fatores de risco associados, identificaram o SCCmec tipo VII (35,9 Kb), cujo elemento móvel se caracteriza também por conter somente o gene mecA como determinante de resistência (BERGLUND et al., 2008). Através de análises de sequencias genéticas foi identificado o SCCmec tipo VIII (32 Kb), que pode ser derivado da recombinação homóloga entre duas cepas de S. epidermidis ou via recombinação de outras cepas de estafilococos, que carreiam cassetes móveis similares. SCCmec tipo VIII é um isolado tipicamente hospitalar, menor que os tipo I, II e III, porém, maior que os tipos associados a CA-MRSA (IV e V) (ZHANG et al., 2005). SCCmec IX (43,7 pb), isolado em 2006 a partir da cepa JCSC6943, originária da Tailândia (LI et al., 2011) e SCCmec X (50,803 pb) também isolado em 2006 a partir da cepa JCSC6945 originário do Canadá (LI et al., 2011). A região J dos tipos SCCmec IX e X carreiam genes relativos a desintoxicação de metais pesados, como o cádmio, o cobre e o zinco. E ambos possuem número de acesso ao Gene Bank. SCCmec XI (http://www.sccmec.org/), foi identificado pelo Instituto Sanger, como ST425, isolado da cepa LGA251, cepa MRSA bovina, listados no site do Grupo de Trabalho Internacional sobre a classificação dos SCCmec, e ainda não possui número de acesso no GeneBank. Essas descobertas reportam à capacidade dos elementos SCCmec de se transferirem horizontalmente entre o gênero Staphylococcus ou passarem por recombinações para gerarem novos tipos SCCmec (ZHANG et al., 2009).

3.7 Técnicas moleculares para tipificação de cepas de estafilococos