M ATERIAIS E M ÉTODOS
4.5 Substância e procedimento do teste
A substância de teste utilizada para irritação cutânea foi o SLS (Pharma Special, Wuppertal, Germany) diluído em água destilada nas concentrações de 0,5%, 1,0%, 2,0% e 5,0% para doses simples e 0,5% e 1,0% para doses repetidas, sendo esta última realizada apenas em coelhos. A pureza do SLS é de 93,33%.
Cinqüenta microlitros de uma solução dissolvida de SLS foram aplicadas em um disco de papel sobre uma câmara (Finn Chambers) de 12 mm (Epitest Ltd Oy, Hyrylä) que ficou em contato com a pele. Essas câmaras têm a vantagem de, quando removidas, deixar marcas bem individualizadas no ponto do teste cutâneo; permitem ainda contato uniforme com a pele e não ocasionam perda ou dispersão do material testado.
4.5.1 Procedimento de irritação primária da pele com dose simples em coelhos Esta avaliação é realizada através da observação e quantificação de reações cutâneas que podem surgir após a aplicação de um produto químico sobre a pele de animais. Os animais são observados por um período determinado de tempo após a aplicação única do produto, permitindo-se assim uma verificação do aparecimento de reações imediatas e tardias.
4.5.1.1 Animais
Foram utilizados 15 coelhos albinos neozelandeses, machos e fêmeas, hígidos e de peso corpóreo de 2,0 a 3,0 kg. Os coelhos albinos foram escolhidos por apresentarem pele mais sensível que a pele humana às substâncias irritantes.
Os animais foram mantidos em gaiolas durante todo o período do teste, em sala de temperatura constante (22 ± 3oC) e de umidade relativa entre 30 e 70%. Os períodos de claro e escuro tiveram ciclos de 12 horas e o regime alimentar é o clássico de laboratório, com água potável ad libitum.
4.5.1.2 Preparo dos animais
Cada animal foi tricotomizado cuidadosamente na área dorsal 24 horas antes do início do teste (Figura 38).
Figura 38 - Área dorsal do coelho tricotomizada.
4.5.1.3 Aplicação do produto
Antes da aplicação do produto, o animal era segurado delicadamente até que se acalmasse. Posteriormente, foi aplicada uma solução salina fisiológica durante 1 minuto para reduzir a impedância do estrato córneo e possibilitar a leitura pelo instrumento de bioimpedância. A seguir, o produto foi aplicado em diferentes concentrações de forma ordenada para facilitar a colocação da substância no local correto. Uma câmara com água destilada também foi colocada em contato com a pele como referência (controle). A substância irritante aplicada e o controle foram ocluídos por adesivos hipoalergênicos e gaze durante 24 horas (Figura 39)
Figura 39 - Oclusão das substâncias irritantes com adesivos hipoalergênicos e gaze.
4.5.1.4 Leitura das reações cutâneas
A leitura por bioimpedância (Figura 40) foi realizada após a aplicação da solução salina fisiológica e antes da aplicação do produto (dia 0) para comparação dos
parâmetros no período anterior e posterior à irritação. A câmara ocluída foi retirada 24 horas após a aplicação do produto. A leitura do teste pela bioimpedância e pelo método visual foi feita durante os dias 2, 3, 4 e 5 após a aplicação do produto e a observação visual foi registrada através de uma câmara digital (Kodak EasyShare) e descrita em um formulário específico (anexo 3). A primeira avaliação foi realizada 24 horas após a retirada do irritante porque o efeito da oclusão permanece durante algumas horas após a remoção da câmara (LÖFFLER & HAPPLE, 2003).
Figura 40 - Aplicação do probe na área dorsal do coelho para leitura de bioimpedância.
A graduação da formação de edema, medida através do paquímetro, e da intensidade das reações cutâneas foi baseada no método de Draize (DRAIZE et al., 1944) (anexo 4).
Após realizar a leitura, foi feito o cálculo do índice de irritação cutânea primária ou índice de Draize. Para se obter os pontos para esta avaliação, somam-se os pontos da formação de edema e da formação de eritema (anexo 4) e calcula-se a média aritmética das avaliações durante o período de observação.
De acordo com o índice de irritação cutânea primária obtido, o produto pode ser classificado em diferentes potenciais de irritação que podem ser observados na tabela 5:
Tabela 5 – Classificação de irritante primário cutâneo.
Valor do Índice Classificação
0 – 0,9 Não irritante
1,0 – 1,9 Ligeiramente irritante
2,0 – 4,9 Moderadamente irritante
5,0 – 8,0 Severo irritante
Como o objetivo do estudo não era classificar o produto em potencial de irritação, mas observar o grau de irritação, a classificação do método visual foi feita através da soma dos pontos de formação de edema e eritema em cada dia de avaliação.
4.5.2 Procedimento de irritação primária da pele com doses repetidas em coelhos Esta avaliação é realizada através da observação e quantificação de reações cutâneas que podem surgir após a aplicação de um produto químico sobre a pele de animais. A substância é aplicada em doses repetidas, a intervalos de 24 horas entre uma aplicação e outra, sobre a pele dos animais de experiência.
Todas as etapas do processo são as mesmas da irritação primária da pele com dose única, com exceção do número de aplicações.
Foram utilizados 15 coelhos albinos neozelandeses diferentes daqueles utilizados no protocolo anterior.
Antes de cada aplicação do produto foi feita a leitura de bioimpedância.
Posteriormente, o produto em baixas concentrações (0,5% e 1,0%) ficou ocluído por 24 horas e, ao final deste tempo, este foi retirado. Após 24 horas todo o procedimento de aplicação foi repetido e assim, sucessivamente, durante 4 dias totalizando quatro aplicações.
A observação dos sintomas edema e eritema nos animais, juntamente com a medição da bioimpedância, e o registro pela câmara digital foram feitos durante os dias 2, 3 e 4 após a primeira aplicação do produto. As lesões foram classificadas baseando-se na tabela de Draize (anexo 4) de acordo com o índice de irritação cutânea primária descrito anteriormente.
4.5.3 Procedimento de irritação primária da pele em humanos
Embora a informação obtida pelo teste animal seja importante, a extrapolação dos resultados para seres humanos, tanto de dose única quanto de doses repetidas do produto, não tem um valor determinado e o teste de contato (patch test) em humanos é indicado.
Por esta razão, foram feitos testes de irritação aguda em humanos que foram relacionados com os resultados obtidos em animais nas mesmas concentrações do produto.
No teste de contato, voluntários humanos são expostos a uma substância de teste sob uma câmara oclusiva no dorso ou na parte anterior do braço. Após 24 horas, a câmara é removida e a pele é classificada pelos sinais apresentados como edema e eritema.
As quatro câmaras contendo o irritante em concentrações diferentes (0,5%, 1,0%, 2,0% e 5,0%) foram aplicadas de forma ordenada nos antebraços anteriores esquerdo e direito em 12 humanos mantendo uma distância de 4 cm (Figura 41). Uma câmara vazia (sem irritante e água destilada) também foi colocada em contato com a pele como referência (controle). No antebraço esquerdo, antes da aplicação do irritante, foi aplicado um produto hidratante (trealose a 5%) para verificar a proteção contra a irritação.
Figura 41 – Localização das câmaras no antebraço esquerdo. As câmaras são numeradas no sentido medial-lateral, proximal-distal.
Antes de cada medida, os indivíduos ficaram em repouso por 15 minutos em local arejado para evitar excesso de suor. A superfície da pele foi umedecida com uma solução salina fisiológica durante 1 minuto para reduzir a alta impedância do estrato córneo e eliminar o suor.
As câmaras ficaram em contato com a pele durante 24 horas e as leituras visuais e por bioimpedância foram realizadas antes da colocação das câmaras (dia 0) e 24 horas após a remoção destas (dia 2).
A avaliação visual foi baseada na escala sugerida por AGNER e SERUP (1990) (tabela 6) e a reação foi registrada por uma câmara digital (Kodak EasyShare) e em formulário específico (anexo 5).
Tabela 6 – Avaliação visual de irritação cutânea em humanos
Reação Resultado
Ausente 0
Leve escamação ou eritema muito fraco 0,5
Eritema fraco e leve infiltração 1
Eritema visível, infiltração, possíveis vesículas e crostas 2 Eritema pronunciado, infiltração, possíveis vesículas, bolhas, pústulas e/ou crostas pronunciadas
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