A superexpressão de Cav-1 aumentou afinidade célula célula, induziu a formação de esferoides maiores e inibiu a

migração

Devido aos resultados anteriores que demonstraram que a GRXEGFP-Cav1 apresentava maior afinidade célula-célula quando comparadas com a GRX (Ilha et al, 2019), o crescimento em 2D das duas linhagens foi analisado através da microscopia eletrônica de varredura (MEV). Podemos notar claramente na figura 8 que as células que superexpressam a Cav-1 apresentaram uma maior afinidade célula-célula, reforçando resultados anteriores mostrados por microscopia óptica (Ilha et al, 2019).

Figura 8: Microscopia eletrônica de varredura (MEV) de monocamadas de células GRX e GRXEGFP-Cav1_.

A célula GRX mostra característica típica de uma cultura semi-confluente de miofibroblastos. A imagem da cultura de GRXEGFP-Cav1 _{mostra seu aumento de afinidade célula-célula com a presença de grumos}

(clusters) celulares.

As culturas de esferoides vem sendo cada vez mais utilizadas por sua similaridade com a arquitetura das células in vivo (Vinci, Gowan et al. 2012). O diferencial das culturas de esferoides 3D é permitir que as células explorem as três dimensões do espaço, aumentando assim a interação com o microambiente e as células vizinhas (Amaral et al 2010). Para analisar esta interação e testar a linhagem proposta anteriormente, foram realizados os experimentos de formação de esferoides como descrito por (Vinci, Gowan et al. 2012). Através das imagens de microscopia óptica, verificou-se a formação de esferoides nas linhagens GRX, GRXEGFP-Cav1 e GRXEGFPpCineo (controle da superexpressão) nas primeiras 24 horas após a semeadura em placas revestidas em agarose 1% (Figura 9A-B). A mensuração do tamanho dos esferoides foi realizada pelo

50 software Image J em 24, 48 e 72 horas de cultura celular. Como mostra a figura 9A-B, o tamanho dos esferoides das GRXEGFP-Cav1 _{foi significativamente maior quando}

comparadas com as linhagens GRXEGFPpCineo _{e GRX, mantendo-se assim ao longo das 72}

horas de cultura celular. Como já mencionado anteriormente e descrito por Ilha, Moraes

et al. 2019 a linhagem que superexpressa Cav-1 tem maior afinidade célula-célula, pela

modulação de proteínas de adesão como a paxilina e a integrina β1 (Iβ1). A Cav-1 também faz ligação com outras proteínas de adesão como as E-caderinas que também podem estar sendo alteradas (Parton and Dal pozo 2013). No entanto, o tamanho dos esferoides das duas linhagens foi diminuindo ao longo do tempo, sugerindo um aumento na compactação celular com o tempo de cultura (figura 9A-B). Em experimentos onde as linhagens foram plaqueadas em placas de petry não aderentes (dados não mostrados), a GRXEGFP-Cav1 formou esferoides mais rapidamente que a linhagem GRX.

Para avaliar a migração, após as 96 horas de incubação, os esferoides foram transferidos para placas aderentes de fundo liso, recobertas ou não com gelatina 0,1% v/v. A migração sobre uma matriz proteica (placas com gelatina) foi avaliada após 4, 6 e 12 dias (Figura 9C). Sendo que, já aos 4 dias, nos esferoides de células GRX a migração é visivelmente maior se comparada com as GRXEGFP-Cav1. Nas células GRX, após 12 dias, as imagens mostram a formação de uma aureola compatível com um padrão radial de migração. Em placas de fundo liso e não recobertas com gelatina os dois tipos celulares apresentaram um padrão disperso de migração, repetindo o resultado anterior (Figura 9C), as GRXEGFP-Cav1 _{migram menos que a GRX (Figura 9D). A superexpressão da Cav-1 e a}

presença de um microambiente em 3D, formação dos esferoides, mostrou novamente o aumento da interação célula-célula e diminuição da migração de células para o substrato do plástico. Estes resultados reforçam os dados anteriores de migração obtidos através do experimento de Wound-healing, onde as células GRXEGFP-Cav1 abriam um espaço maior da camada celular, com aumento da afinidade célula-célula dependente da confluência celular (Ilha, Morares et al. 2019). O papel da Cav-1 na migração celular ainda continua controverso. Existem muitos dados na literatura indicando que a Cav-1 promove a migração em vários tipos celulares incluindo, fibroblastos, células endoteliais e células derivadas de tumores dependentes da presença da Tyr14 da Cav-1. Alternativamente a inibição da migração é observada em astrócitos, carcinoma de endotélio e pancreático e células metastáticas de câncer de mama. Em células metastáticas de adenocarcinoma mamária, a presença da Cav-1 é associada com a extensão reduzida das protrusões

51 celulares e a migração com a estimulação de EGF. Em câncer hepatocelular, a associação da Cav-1 com a invasão e sobrevivência foi relatada com o aumento da expressão de MMP (Urra, Torres et al. 2012).

Figura 9: A superexpressão de Cav-1 aumentou afinidade célula-célula, induziu a formação de maiores esferoides e inibiu a migração. A) A formação de esferoides das células GRX e GRXEGFP-Cav1 _{em 24, 48 e 72h de cultura celular.} B) As células GRXEGFP-Cav1 _{formaram esferoides maiores em todos os tempos celulares em comparação a GRX e} GRXEGFPpCineo_{. As imagens foram quantificadas pelo software ImageJ. C) Células GRX e GRX}EGFP-Cav1 _{no experimento} de migração em placas revestidas com gelatina em 4, 6 e 12 dias de cultura celular. As células GRX apresentaram uma auréola compatível com padrão de migração radial. As células GRXEGFP-Cav1 _{apresentaram padrão de migração difusa.} D) As células GRX e GRXEGFP-Cav1 _{no experimento de migração sobre plástico em 0 e 4 dias de cultura celular. As} células GRX apresentaram maior migração sobre o plástico do que as células GRXEGFP-Cav1_{. Aumento de 200x.}

52

Figura 10: Morfologia externa e interna da cultura dos esferoides. A) As células GRX e GRXEGFP-Cav1 _{através da MEV} mostram um formato arredondado e produção de matriz extracelular (MEC) acentuada nas duas linhagens. Magnificação 5, 10 e 50 µm. B) As células GRX e GRXEGFP-Cav1 _{através da MET mostram o conteúdo celular e a} morfologia celular da parte da borda e do centro dos esferoides. Ambas as células foram sinalizadas e marcadas em pintura colorida para melhor visualização da delimitação dos seus citoplasmas. As células GRX apresentaram na borda celular maior contato entre célula-célula, produção de MEC e núcleos inteiros. Já na parte do centro há um maior

53

espaçamento entre as células e núcleos celulares inteiros. As células GRXEGFP-Cav1 _{apresentaram tanto na borda quanto} no centro do esferoide um maior extravasamento do conteúdo citoplasmáticos, maior produção de MEC e maior espaçamento celular com núcleos (N) picnóticos e eletrodensos. Magnificação 5 µm.

Em alguns tipos de cânceres, como por exemplo, câncer de mama, a superexpressão de Cav-1 inibe a metástase, a adesão, a proliferação e a migração celular, enquanto em outros tipos de câncer a Cav-1 foi reportada a induzir este fenômeno (Gupta, Toufaily et al. 2014). Concluímos que com a superexpressão de Cav-1 e a interação com um microambiente em 3D, houve um aumento da interação célula-célula e uma diminuição da migração das células GRXEGFP-Cav1 para o substrato plástico em comparação as células GRX.

Para visualizar o formato e a produção de MEC na cultura dos esferoides, as células GRX e GRXEGFP-Cav1 após 4 dias de cultura celular em placas de fundo U e agarose 1%, foram preparadas para MEV e MET. Através da MEV podemos visualizar a produção de MEC na superfície dos esferoides nas duas linhagens celulares (Figura 10A). Logo após, as culturas de esferoides foram preparadas para a MET para uma análise da morfologia interna. (Figura 9B). Na parte cortical dos esferoides de células GRX foram observadas células intactas, evidenciando o contato entre células. Já na parte medular do esferoide, há um maior espaçamento entre as células, produção de MEC e um extravasamento do conteúdo citoplasmático. Já nos esferoides de células GRXEGFP-Cav1, tanto na parte cortical quanto na parte medular, encontramos células com núcleos picnóticos e eletrodensos característicos de vias de morte por hipóxia e apoptose/necrose, extravasamento do conteúdo citoplasmático e com muita produção de MEC. Com isso, podemos concluir que as culturas de esferoides são ótimas ferramentas experimentais para serem utilizadas futuramente em testes para reversão do fenótipo ativado ou das vias de apoptose/necrose com drogas, fármacos e interações com outros tipos celulares.