hematológicos e imunológicos de gatos em crescimento
Artigo formatado segundo as normas da revista Journal of Animal Physiology
Resumo
Trinta gatos com 80 dias de idade (919,16 ± 120,34g) foram usados com o objetivo de determinar os efeitos de fontes inorgânicas vs. biocomplexadas e diminuição suplementar de Cu, Fe, Mn, Se e Zn na atividade de metaloenzimas, metabolismo de Fe e índices hematológicos e imunológicos. Microminerais inorgânicos (ING) foram comparados a quatro níveis de microminerais biocomplexados (BIO) sob a forma de proteinatos (Bioplex®TR Se). A dieta 100%ING foi suplementada com 8,4mgCu/kg (sulfato), 80mg de Fe/kg (sulfato), 4,80mg de Mn/kg (sulfato), 0,30mg de Se/kg (selenito) e 75mg de Zn/kg (sulfato); e o Bioplex®TR Se foi usado como substituto na mesma concentração mineral (100%BIO) ou em proporções menores (80%BIO, 60%BIO e 40%BIO) nas demais dietas, totalizando cinco tratamentos. Os animais foram alimentados durante 140 dias com as dietas em delineamento inteiramente ao acaso, totalizando 6 repetições por tratamento. Não houve diferença (p>0,05) entre as fontes ING e BIO, nos seus diferentes níveis, para atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD), glutationa peroxidase (GPx), fosfatase alcalina (FA); níveis plasmáticos de malondialdeído (MDA); Fe sérico; concentração de transferrina; capacidade latente (CLLFe) e total de ligação do ferro (CTLFe); índice de saturação da transferrina (IST); hemograma (exceto hemoglobina corpuscular média – HCM), leucócitos e linfócitos totais. Comparado com a fonte inorgânica (100%ING), o grupo suplementado com 80%BIO apresentou maior atividade da ceruloplasmina; e todos os grupos que receberam o biocomplexo apresentaram maior hemoglobina corpuscular média (HCM) (p<0,05). A atividade da ceruloplasmina aumentou quadraticamente com o aumento da suplementação BIO (p<0,05). Conclui-se que a suplementação de níveis menores de microminerais organicamente complexados sob a forma de proteinato (Bioplex®TR Se), em vez de suas formas inorgânicas, não afeta negativamente a defesa antioxidante, atividade enzimática, parâmetros
relacionados ao metabolismo de ferro e índices hematológicos de gatos em crescimento.
Palavras-chave: defesa antioxidante, enzimas, filhotes, minerais.
Introdução
Microminerais como cobre (Cu), ferro (Fe), manganês (Mn), selênio (Se) e zinco (Zn) são essenciais para a atividade de diversas enzimas celulares, participando então de vários processos bioquímicos. A importância da deficiência de microminerais está relacionada, dentre outros motivos, ao fato deles estarem presentes em diversas enzimas, como as antioxidantes: a superóxido dismutase (Cu, Zn e Mn) e glutationa peroxidase (Se), bem como na ceruloplasmina (Cu) e fosfatase alcalina (Zn). Mas também vale ressaltar que os microminerais desempenham função na manutenção de fatores hematológicos (ferro, cobre e zinco), metabolismo de lipídeos (cobre) e função imunológica (ferro, cobre, selênio e zinco). Assim, a determinação da atividade enzimática ou de componentes essenciais metabólicos têm sido usados como critérios de avaliação da biodisponibilidade de minerais, uma vez que funções fisiológicas são progressivamente afetadas pela deficiência desses elementos (Miles e Henry, 2000).
Nos mecanismos de defesa antioxidante, a SOD é responsável por acelerar a conversão do radical superóxido (O2
-
) em peróxido de hidrogênio (H2O2), o qual
é então reduzido pela GPx em água (Finkel e Holbrook, 2000). Isso evita que o radical livre ataque lipídeos de membrana, resultando na produção de outros compostos como, por exemplo, o malondialdeído (MDA). A ceruloplasmina é uma enzima que possui diversas funções no organismo como: em reações de fase aguda da inflamação (Aggett, 1985; Linder e Hazeg-Azam, 1996); na defesa antioxidante; no transporte de Cu do fígado para outros órgãos (Linder et
al., 1998) e auxilia na liberação ou ligação de Fe de armazenamento para transferrina (Linder e Hazeg-Azam, 1996).
A fosfatase alcalina é uma enzima que requer o Zn como cofator (Adeniyi e Heaton, 1980) na catalização da hidrólise de fosfomonoésteres com a liberação de fosfato inorgânico (Mornet et al., 2001) e é um importante marcador da atividade osteoblástica (Sabokbar et al., 1994).
Nos parâmetros hematológicos o Fe é usado em sua maioria pelas células precursoras eritróides na produção de hemoglobina (McCown e Specht, 2011). O Cu está relacionado à manutenção do fornecimento de Fe funcional devido à importância de proteínas que contêm Cu, como a hefaestina e ceruloplasmina (Bohn, 2015), de modo que a deficiência desse elemento resulta na diminuição da liberação de Fe do enterócito para o plasma e de tecidos de armazenamento de Fe (Harvey, 2008). A redução do fornecimento de Zn tem sido associada a danos (Kraus et al., 1997; Shakoori et al., 1990) ou inibição da formação de eritrócitos (Shakoori et al.,1990) .
Quanto ao sistema imunológico, os microminerais são totalmente relevantes e podem ser usados como estratégia para otimizar a função desse sistema, principalmente pela redução do estresse metabólico e oxidativo (Andrieu, 2008; Weiss e Wyatt, 2002). Os microminerais também podem exercer importante função no sistema imune, por meio de mecanismos específicos como, por exemplo, no caso do Zn que afeta a imunidade via seu papel importante na replicação e proliferação celular (Spears e Weiss, 2008).
A suplementação de microminerais nas dietas de gatos filhotes tem sido feita tradicionalmente por meio da utilização de sais inorgânicos como sulfatos e óxidos. No entanto, após a descoberta de diversos fatores intrínsecos e extrínsecos que podem vir a afetar a biodisponibilidade dos elementos sob essa forma, tentativas têm sido lançadas no intuito de melhorar sua utilização por animais (Buzadžć et al., 2002). Assim, a proposta do uso de minerais
organicamente complexados como, por exemplo, metal proteinato, tem sido de grande interesse na nutrição animal. Ainda assim, devido a sua maior biodisponibilidade, a necessidade de inclusão de microminerais sob a forma biocomplexada na dieta parece ser menor (Richards et al., 2010; Schiavon et al., 2000).
Dessa forma, objetiva-se com o presente estudo determinar os efeitos da redução suplementar de Cu, Fe, Mn, Se e Zn na forma de proteinato sobre a atividade de metaloenzimas, metabolismo de ferro e índices hematológicos e imunológicos de gatos em crescimento.
Material e métodos
Todos os procedimentos experimentais estiveram de acordo com os Princípios Éticos da Experimentação Animal adotados pela Comissão de Ética no Uso de Animais (Comissões/ Permanentes/PRP-UFLA- Protocolo nº 049/13).
Animais
Trinta gatos filhotes saudáveis, sendo 15 machos e 15 fêmeas foram distribuídos de forma semelhante entre as dietas experimentais. Os filhotes aos 80 dias de idade e com peso médio inicial de 919,16 ± 120,34g, foram alojados em gaiolas suspensas com dimensões de 0,8 x 0,8 x 1,0m (altura x profundidade x largura). As vacinas foram realizadas aos 60, 90 e 120 dias de idade (Nobivac Feline, MSD Saúde Animal Inc., Alemanha) e vermifugação aos 30 e 45 dias de idade (Basken Suspensão, König Inc., Argentina). O estudo foi conduzido durante 120 dias.
Dietas experimentais e manejo alimentar
Os filhotes foram distribuídos em cinco tratamentos (dietas experimentais secas extrusadas): (1) 100% ING [100% da suplementação de microminerais recomendada pelo NRC (2006) de fonte inorgânica]; (2) 100% BIO [100% da suplementação de microminerais recomendada pelo NRC (2006) de fonte biocomplexada]; (3) 80% BIO [80% da suplementação de microminerais recomendada pelo NRC (2006) de fonte biocomplexada]; (4) 60% BIO [60% da suplementação de microminerais recomendada pelo NRC (2006) de fonte biocomplexada]; (5) 40% BIO [40% da suplementação de microminerais recomendada pelo NRC (2006) de fonte biocomplexada] (Tabela 1).
As recomendações de microminerais indicadas pelo NRC (2006) para dietas de gatos filhotes são: 8,4mg de Cu/kg; 80mg de Fe/kg; 4,8mg de Mn/kg; 0,3mg de Se/kg e 75mg de Zn/kg, na matéria seca, considerando um alimento com aproximadamente 4000kcal de energia metabolizável/kg. As dietas foram isoenergéticas e isoproteicas, diferenciando apenas na quantidade e fonte de microminerais suplementados (Tabelas 2 e 3).
Os microminerais inorgânicos foram suplementados como sulfato de cobre, sulfato de ferro, sulfato de manganês, selenito de sódio e sulfato de zinco. A fonte de mineral biocomplexada foi fornecida por fontes proteinatas disponíveis comercialmente (Bioplex®TR Se Gatos, Alltech Inc., Estados Unidos), obtida a partir de proteína de soja hidrolisada enzimaticamente; exceto o Se biocomplexado, que foi a partir de uma proteína de levedura, principalmente como selenometionina. Os alimentos foram fornecidos diariamente na quantidade de 150gramas, possibilitando a obtenção de sobra. Água foi fornecida ad libitum.
Tabela 1 Ingredientes das dietas experimentais secas extrusadas para gatos filhotes. Ingredientes (g/kg na matéria natural) 100% ING 100% BIO 80% BIO 60% BIO 40% BIO Farinha de vísceras de frango 243,33 243,33 243,33 243,33 243,33 Arroz quirera 200,00 200,00 200,00 200,00 200,00 Soja farelo 45% 200,00 200,00 200,00 200,00 200,00 Milho grão 94,90 94,90 94,90 94,90 94,90 Farinha de peixe 82,21 82,21 82,21 82,21 82,21 Óleo de frango 60,39 60,39 60,39 60,39 60,39 Farelo de trigo 50,00 50,00 50,00 50,00 50,00 Palatabilizante 30,00 30,00 30,00 30,00 30,00 Semente de linhaça 20,00 20,00 20,00 20,00 20,00 Premix vitamínico* 5,00 5,00 5,00 5,00 5,00 Acidificante 3,50 3,50 3,50 3,50 3,50 Mananoligossacarídeo 2,50 2,50 2,50 2,50 2,50 DL-metionina 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 Taurina 1,67 1,67 1,67 1,67 1,67 Corante 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 Propionato de cálcio 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 Extrato de Yucca schidigera 0,30 0,30 0,30 0,30 0,30
Antioxidante 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20
Premix inorgânico† 2,00 - - - -
Premix biocomplexadoffi - 2,00 1,60 1,20 0,80
Inerte (caulim) - - 0,40 0,80 1,20
*Premix vitamínico forneceu os seguintes níveis de vitaminas por quilograma de alimento: vitamina A (18000UI), vitamina D3 (1200UI), vitamina E (200UI), vitamina K (0,15mg), tiamina (25mg), riboflavina (15mg), ácido pantotênico (35mg), niacina (150mg), piridoxina (10mg), ácido fólico (2mg), biotina (0,2mg) vitamina B12 (0,07mg), colina (2200mg).
†Premix mineral inorgânicocontinha no mínimo, por quilograma do premix: 40500mg de ferro (sulfato de ferro), 4200mg de cobre (sulfato de cobre), 2400mg de manganês (sulfato de manganês), 37500mg de zinco (sulfato de zinco), 1820mg de iodo (iodato de cálcio), 150mg de selênio (selenito de sódio)
ffiPremix mineral biocomplexadocontinha no mínimo, por quilograma do premix: 40500mg de ferro (proteinato de ferro), 4200mg de cobre (proteinato de cobre), 2400mg de manganês (proteinato de manganês), 37500mg de zinco (proteinato de zinco), 1820mg de iodo (iodato de potássio), 150mg de selênio (levedura enriquecida com selênio)
Tabela 2 Quantidades suplementares de microminerais de fontes inorgânicas (ING) ou biocomplexadas (BIO) utilizadas experimentalmente em dietas para gatos filhotes.
Dietas mg/kg de alimento na matéria seca
Cobre Ferro Manganês Selênio Zinco
100% ING* 8,40 80,00 4,80 0,30 75,00
100% BIO† 8,40 80,00 4,80 0,30 75,00
80% BIO 6,72 64,80 3,84 0,24 60,00
60% BIO 5,04 48,60 2,88 0,18 45,00
40% BIO 3,36 32,40 1,92 0,12 30,00
*ING (fontes inorgânicas) - sulfato de cobre, sulfato de ferro, sulfato de manganês, selenito de sódio e sulfato de zinco.
†BIO (fontes biocomplexada) - proteinato de cobre, proteinato de ferro, proteinato de manganês, levedura enriquecida com selênio, proteinato de zinco.
Tabela 3 Quantidade de microminerais de fonte inorgânica (ING) e biocomplexada (BIO) nas dietas experimentais para gatos filhotes e premixes após análise laboratorial.
Dietas mg/kg na matéria seca
Cobre Ferro Manganês Selênio Zinco
100% ING 25,77 433,85 37,98 0,38 149,66 100% BIO 26,42 412,90 37,71 0,40 156,53 80% BIO 24,10 353,47 36,21 0,37 137,45 60% BIO 22,32 343,15 35,13 0,28 125,67 40% BIO 20,17 326,17 34,31 0,23 108,13 Premix ING 3929,62 43685,43 4104,64 95,99 38769,56 Premix BIO 4243,53 47739,07 4026,54 188,73 42416,17
Atividade enzimática e peroxidação lipídica
Nos dias 0 e 120 do período experimental os animais foram submetidos a coletas de sangue para a determinação da atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD) e glutationa peroxidase (GPx) e da concentração de malondialdeído (MDA) pela mensuração de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). As amostras foram coletadas com os gatos em jejum de
12 horas, usando como acesso a veia jugular e, posteriormente, colocadas individualmente em mini tubos contendo anticoagulante heparina (Mini Tubos, Labor Import Co., Brasil) e rapidamente preservados imersos no gelo até o processamento em centrifuga a 1000xg por 10 minutos a temperatura de 4ºC (modelo 2K-15 Sigma Laborzentrifugen, Sigma, Alemanha). Após centrifugação, o plasma foi removido e armazenado em microtubos tipo eppendorf e congelado a temperatura de -80ºC até a realização das análises, que ocorreu até 30 dias após a coleta. Para o ensaio foram usados os kits comerciais Superóxido Dismutase Assay Kit (Cayman Chemical Co., Estados Unidos), Glutationa Peroxidase Assay Kit (Cayman Chemical Co., Estados Unidos) e TBARS Assay Kit (Cayman Chemical Co., Estados Unidos), seguindo-se o protocolo recomendado pelo fabricante. Todas as análises foram feitas em duplicata para cada parcela experimental e as leituras das microplacas em espectrofotômetro automático de microplacas (MultiskanTM GO Microplate Spectrophotometer, Thermo Scientific Inc., Alemanha).
Aos dias 0, 60 e 120 do experimento também foram realizadas coletas sanguíneas, nos animais em jejum de 12 horas, para a determinação da atividade das enzimas fosfatase alcalina e ceruloplasmina. As amostras sanguíneas para fosfatase alcalina foram colocadas individualmente em mini tubos com gel separador de soro (Minicollect® com gel separador de soro, Greiner Bio-One Inc., Austria). A centrifugação foi feita a 3500rpm durante 10 minutos a 20ºC (modelo Elektra Ecoline, Laborline, Brasil). No ensaio usou-se a avaliação da atividade catalítica da enzima sobre o substrato p-nitrofenil fosfato sob leitura em espectrofotômetro (modelo Labmax240, Labtest Diagnóstica S/A, Brasil) a 405nm por meio de kit enzimático (Fosfatase alcalina Liquiform, Labtest Diagnóstica S/A, Brasil).
As amostras destinadas a análise de ceruloplasmina foram colocadas em tubos sem anticoagulante (Vacuette® Z Serum Clot Activator, Greiner Bio-one
Inc., Austria), centrifugadas a 3000xg durante 10 minutos (Modelo 2-6, Sigma Laborzentrifugen, Sigma, Alemanha), sendo o soro armazenado em microtubos tipo eppendorfa -20ºC até a realização da análise. O ensaio foi feito por meio da oxidação da o-dianisidina di-hidrocloreto (o-dianisidine dihydrochloride, Sigma Aldrich Co., Estados Unidos) usando o método de Schosinsky et al. (1974), com adaptações para a espécie. Os ensaios foram conduzidos a 37°C, utilizando um tampão de acetato de sódio 0,1 mol/L. Como o pH ótimo para a atividade de oxidases varia com a espécie (Prohaska, 1991) e a ceruloplasmina em gato tem atividade máxima em pH 5,8 (Fascetti et al., 2002), o tampão usado para análise foi feito a esse pH. A absorbância do produto da reação foi mensurada a 540nm por espectrofotômetro de cubeta (MultiskanTM GO Microplate Spectrophotometer, Thermo Scientific Inc., Alemanha). Uma unidade da atividade da ceruloplasmina foi definida como a quantidade de enzima oxidando 1µmol/min de substrato usando um coeficiente de extinção molar de 9600mol/L/cm (Schosinsky et al.,1974).
Capacidade de ligação do ferro
Também nos dias 0, 60 e 120 foram coletadas amostras de sangue para determinação da capacidade de ligação do Fe (Fe sérico, capacidade latente de ligação do Fe, capacidade total de ligação do Fe, índice de saturação do Fe e concentração de transferrina) em mini tubos com gel separador de soro (MiniCollect® com gel separador de soro, Greiner bio-one Inc., Austria). A centrifugação foi feita a 3500rpm durante 10 minutos a 20ºC (modelo Elektra Ecoline, Laborline, Brasil).
Para avaliação do Fe sérico e a capacidade latente de ligação do Fe (CLLFe) foi utilizado o método colorimétrico de Goodwin modificado, por meio da adição de Ferrozine®, com reagentes comerciais (Labteste Diagnóstica S/A, Brasil). As leituras foram feitas em espectrofotômetro (modelo Labmax240,
Labtest Diagnóstica S/A, Brasil), na faixa de 560nm. A partir dessas análises foram calculadas a capacidade total de ligação do Fe (CTLFe), índice de saturação da transferrina (IST) e transferrina, conforme segue: CTLFe (µg/dL) = Fe sérico + CLLFe; IST (%) = (Fe sérico/CTLFe) x 100; e Transferrina (mg/dL) = CTLFe x 0,70.
Perfil hematológico
Ainda aos dias 0,60 e 120 as amostras sanguíneas foram colocadas em mini tubos com anticoagulante EDTA K2 (Labor Import Co, Brasil) e analisadas por método automatizado por meio de um analisador hematológico veterinário (modelo pocH-100iv-Diff, Sysmex Co, Japão).
Análises estatísticas
O experimento foi analisado em delineamento inteiramente casualizado, de modo que 30 gatos foram distribuídos em cinco tratamentos, totalizando assim seis animais por tratamento, sendo a unidade experimental cada gato. Todos os dados foram previamente analisados para normalidade pelo teste Shapiro-Wilk e quando necessário eles foram transformados em log antes de serem analisados estatisticamente. Os dados foram submetidos à análise de covariância, sendo as medidas no tempo 0 as covariáveis e em seguida à análise de variância com dieta e tempo como fatores, exceto atividade das enzimas SOD, GPx e peroxidação lipídica, os quis foram submetidos à análise de variância, com dieta como único fator. Foi realizado Teste de Dunnet para comparação de cada nível de suplementação do biocomplexo ao grupo inorgânico e procedeu-se análise de regressão para os níveis do suplemento sob a forma de biocomplexo pelo PROC GLM (SAS, Inst., Inc., Cary, NC). Significância foi declarada a p<0,05.
Resultados
Atividade enzimática e peroxidação lipídica
Nenhuma diferença em resposta a fonte e efeito de níveis suplementares da fonte biocomplexada foi observada na atividade das enzimas SOD, GPx e na peroxidação lipídica (concentração de MDA) (p>0,05)(Tabela 4). Não foi observada interação dieta x tempo para a atividade das enzimas fosfatase alcalina e ceruloplasmina (p>0,05) (Tabela 5). Não houve efeito (p>0,05) da dieta sobre a atividade da fosfatase alcalina, mas foi observado efeito do tempo (p<0,05). A atividade da enzima ceruloplasmina foi maior (p<0,05) nos animais alimentados com 80%BIO quando comparado aqueles alimentados com 100%ING; e entre os níveis BIO, a atividade aumentou quadraticamente (p<0,05) com o aumento da suplementação do biocomplexo (Tabela 5).
114 Tabela 4 Atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD) e glutationa peroxidase (GPx) e cocnentração de
dialdeído malônico (MDA) de gatos filhotes alimentados com diferentes fontes (inorgânica - ING ou biocomplexada - BIO) e níveis de microminerais (cobre, ferro, manganês, selênio e zinco) BIO.
Item 100% ING Níveis suplementares (BIO) p-valor EPM
100% 80% 60% 40%
SOD (U/mL) 6,14 6,23 4,84 3,8 4,61 0,33 0,42
GPx (nmol/min/mL) 5842 5577 5270 4941 4984 0,46 172,33
MDA (µM) 3,55 2,67 3,66 3,07 3,74 0,18 0,16