Dentre as cepas de rizóbios avaliadas, a L84 e L85 foram as únicas que não manifestaram nenhum tipo de resistência. Com esses resultados é possível afirmar que após o teste de resistência, houve uma alteração no espectro de ação das actinobactérias antagonistas sobre as bactérias diazotróficas. A cepa UB08 passa a ser classificada como não antagonista e as cepas UB10, UB19 e UB21 tiveram seu espectro de ação contra os rizóbios reduzido.
4.3 Identificação genética das cepas
Dentre as 28 cepas selecionadas para identificação molecular, somente quatro obtiveram sucesso no sequenciamento. O sequenciamento das demais cepas não apresentou nenhum resultado (nenhuma sequência genética foi obtida).
0 1 2 3 4 5 6 7 N º d e c e p a s a n ta g o n is ta s
Cepas de bactérias diazotróficas
Suscetibilidade dos rizóbios após o teste de
resistência
Suscetivel Resistente Menos suscetivel
Foram identificadas uma cepa de actinobactéria (UB26) e três cepas de bactérias diazotróficas (L91, L94 e L98). A classificação está apresentada na tabela 4.3.1.
Tabela 4.3.1 - Identificação das cepas após o sequenciamento genético. Cepas Sequência de Tamanho da Espécie Similaridade
Escolha sequência identificada (%) UB26 Senso (U) 323 pb Streptomyces sp. 100
L94 Anti-senso (L) 324 pb Bradyrhizhobium 100
retamae
L91 Anti-senso (L) 324 pb Endobacter 99 medicaginis
L98 Anti-senso 313 pb Burkholderia sp. 99
Fonte: elaborada pelo autor
5 DISCUSSÃO
Os resultados obtidos evidenciaram a ação inibitória “in vitro” das actinobactérias sobre os rizóbios. Antagonismo entre esses grupos de microrganismos também foram também relatados por Van Schreven 1964, Patel 1974, Pugashetti et al., 1982, Pereira et al., 1999, Gregor et al., 2003 e Lima et al., 2017.
Os trabalhos citados revelaram que a atividade antibiótica das cepas de actinobactérias frente aos rizóbios foi variada entre as diferentes cepas de ambos os grupos de bactérias reforçando os resultados obtidos nesse trabalho.
Supõe-se que a variação da atividade antagônica foi determinada pela diversidade dos grupos bacterianos avaliados. A diversidade cultural das cepas utilizadas nesse estudo foi evidenciada por Brito et al., 2015 para as actinobactérias e Silva et al., 2014 e Feitoza et al., 2015 para as bactérias diazotróficas.
Estudos que utilizaram cepas de actinobactérias, pré-selecionadas por apresentar atividade antibiótica, e não pertencentes ao mesmo local de origem, resultaram em um maior número de interações antagonistas entre essas bactérias (VAN SCHREVEN, 1964; PUGASHETTI et al., 1982; GREGOR et al., 2003).
Nesse trabalho ambos os grupos de bactérias foram isolados do mesmo solo e desse modo foram obtidas cepas de bactérias nativas. O uso de bactérias nativas para estudos de antagonismo “in vitro” é interessante, pois permite presumir o comportamento desse grupo de bactérias no solo.
De acordo com Pereira et al., 1999 a suscetibilidade a antibióticos pelas bactérias diazotróficas está diretamente relacionada com a antibiose exercida pelas populações da comunidade microbiana do solo das quais foram isoladas e que o percentual de microrganismos antagonistas no solo é um fator determinante no nível de sensibilidade dos rizóbios a ação antibiótica.
Os resultados obtidos reforçam essa idéia, pois houve um maior percentual de rizóbios não suscetíveis às substâncias antimicrobianas produzidas pelas cepas de actinobactérias. Como esses microrganismos foram isolados do mesmo solo, presume-se que eles já tenham interagido entre si no solo e ao longo do tempo promovendo maior coexistência entre esses grupos.
As bactérias utilizadas nesse estudo foram oriundas de solos do semiárido brasileiro, região que apresenta condições ambientais severas para a
maioria dos organismos vivos e que favorece a competição entre os microrganismos (GORLACH-LIRA; COUTINHO, 2007; VINHAL-FREITAS et al., 2010; PAGANO et al, 2013; SOUTO et al., 2013; FREITAS et al., 2014; LIMA et al., 2014; SILVA et al., 2015a).
Lima et al., 2017 conduziu um estudo similar utilizando bactérias isoladas desses solos. Apesar de também ter encontrado resultados similares com relação à atividade antagonista entre os grupos de bactérias, seus resultados divergiram em relação ao gênero das espécies de actinobactérias antagonistas, que foram identificadas somente como Streptomyces spp. Nesse trabalho, os resultados revelaram actinobactérias antagonistas pertencendo a três gêneros distintos:
Terrabacter spp., Nocardia spp. e Streptomyces spp.
Isso pode ser explicado pela possível diferença de diversidade biológica entre as amostras de solo das quais os microrganismos foram isolados, pois nesse trabalho ambos os grupos de bactérias foram isolados a partir de solo rizosférico diferindo de Lima et al., 2017 que utilizou amostras de solo não rizosférico e serapilheira.
Segundo Dantas et al., 2009, Huang et al., 2014 e Pii et al., 2015, a rizosfera apresenta uma diversidade microbiológica elevada quando comparada com o solo não-rizosférico pois está sob influência das raízes de plantas e por isso esse compartimento do solo é bastante competitivo para os microrganismos.
Conforme discutido anteriormente, solos do semiárido brasileiro apresentam condições favoráveis à competição entre os organismos. Espera-se, portanto, maior competitividade entre os microrganismos provenientes desses solos. Entretanto, os dados obtidos não refletem isso.
O espectro de ação das actinobactérias antagonistas frente às bactérias diazotróficas revelou que mais da metade das cepas de actinobactérias foram capazes de inibir somente uma cepa de rizóbio, o que pode indicar baixo potencial antagonista dessas actinobactérias e baixa competitividade entre esses grupos. Além disso, aproximadamente 74% dos rizóbios não foram suscetíveis a nenhuma cepa de actinobactéria o que sugere a adaptação dos rizóbios à ação anti- microbiana das actinobactérias contribuindo para coexistência entre esses dois grupos de bactérias.
A incidência de actinobactérias com baixo potencial antagonista no solo representa uma vantagem para a população de rizóbios uma vez que o efeito inibitório dessas actinobactérias terá menor impacto sobre essas bactérias no solo.
É importante, também, ressaltar o papel das actinobactérias com maior potencial antagonista no solo. Dentre as 27 cepas avaliadas, apenas quatro (UB10, UB11, UB12 e UB20) destacaram-se em relação ao seu potencial antagonista que foi evidenciado pelo espectro de ação contra os rizóbios e pelos valores dos índices inibitórios e pertencem ao gênero Streptomyces spp. (UB10) e Nocardia spp. (UB11, UB12 e UB20).
Apesar da baixa incidência, essas cepas podem ter ação benéfica sobre a comunidade microbiana do solo agindo como inibidores de fitopatógenos tais como
Ralstonia solanacearum (GAVA et al., 2002), Agrobacterium tumefaciens (MOKNI-
TLILI et al., 2013) e Sclerotium rolfsii (ERRAKHI et al., 2009).
Actinobactérias com elevado efeito antagonístico também apresentam potencial biotecnológico e a utilização das suas substâncias antimicrobianas nas ciências médicas e indústria farmacêutica é bastante difundida em função da crescente emergência de bactérias resistentes a antibióticos.
Na rizosfera espera-se encontrar populações de rizóbios que devem ser capazes de competir e infectar as plantas hospedeiras. No entanto, a rizosfera compreende várias populações de diferentes microrganismos e alguns deles produzem naturalmente antibióticos que são letais para populações suscetíveis de rizóbios no solo.
Nesse contexto, a resistência intrínseca aos antibióticos é uma característica desejável para a população rizobiana, pois aumenta as chances de crescimento, multiplicação e persistência no solo. Resistência intrínseca refere-se à resistência inerente à célula bacteriana que impede a ação de substâncias antimicrobianas (DAVIES; DAVIES, 2010; RUBAN; GUNASEELAN, 2011; NAAMALA et al., 2016).
Nesse trabalho, os padrões de suscetibilidade e resistência dos rizóbios à ação inibitória das actinobactérias foram variados e refletem a caracterização dessas cepas que revelou resistência intrínseca a antibióticos diversificada no qual cada cepa se mostrou resistente a pelo menos 10 tipos diferentes de antibióticos (SILVA
Esses dados estão de acordo com as ideias defendidas por Davies; Davies 2010 e Ruban; Gunaseelan 2011. Eles afirmam que as bactérias de um mesmo grupo não apresentam o mesmo perfil metabólico, bioquímico e fisiológico devido à alta diversidade entre elas exibindo uma resposta diferencial em relação às substâncias antimicrobianas e com isso, nem todos os antibióticos são ativos contra todas as bactérias do grupo, e essas bactérias podem ter resistência intrínseca a um ou mais antibióticos.
É importante ressaltar que fatores tais como a produção de muco pelas bactérias diazotróficas afetou a sua suscetibilidade às actinobactérias. As cepas L86 e L93 não foram suscetíveis e produziram muco ao redor da colônia das actinobactérias. O muco pode ter servido como uma barreira de proteção à ação das actinobactérias formando um bloqueio contra a dispersão dos antibióticos no meio de cultura.
A produção de exopolissacarídeos (muco) como um mecanismo de defesa aos estresses ambientais pelas bactérias diazotróficas é defendida por Coutinho et al., 1999, Fernandes-Júnior et al., 2010, Bomfeti et al., 2011 e Ferreira et
al., 2012.
Estudos relacionados à adaptação e resistência das bactérias diazotróficas às actinobatérias antagonistas são relevantes uma vez os rizóbios apresentam importância agrícola e ecológica, pois são muito utilizados como bio- inoculantes e estão envolvidos no ciclo do nitrogênio afetando a disponibilidade desse nutriente no solo e dessa maneira influenciando o crescimento de plantas e outros organismos.
Entretanto, estudos envolvendo a resistência de rizóbios frente às actinobactérias antagonistas “in vitro” são escassos. A resistência dos rizóbios com actinobactérias foi avaliada “in vitro” por Van Schreven 1964 e Pereira et al., 1999, e “in vivo” por Pereira et al., 2013. No Brasil isso ganhou maior notoriedade após o fracasso no uso de inoculantes em solos da região do Cerrado.
Cepas de rizóbios selecionadas apresentaram alta eficiência em testes de laboratório e campo, entretanto, não conseguiram se estabelecer no solo devido à ação antagonista da microbiota nativa, particularmente, as actinobactérias (PEREIRA et al., 1999).
A obtenção de resistência pelas bactérias diazotróficas representa um mecanismo que permite a sua coexistência com outras bactérias antagonistas no
solo. As cepas estudadas nesse trabalho apresentaram resistência às actinobactérias antagonistas que foi evidenciada tanto pela ausência dos halos de inibição como também pela redução da suscetibilidade manifestada pela redução no tamanho da zona de inibição.
Van Schreven 1964 e Pereira et al., 1999 obtiveram cepas de rizóbios resistentes às actinobactérias estando de acordo com os resultados obtidos nesse estudo. Entretanto o relato de Van Schreven 1964 divergiu com relação à espécie, pois utilizou cepas de Rhizobium meliloti.
Nesse estudo foram utilizadas para o teste de resistência somente rizóbios pertencentes ao gênero Bradyrhizobium spp. Em todos os casos citados as bactérias diazotróficas apresentaram comportamento diferenciado em relação à resistência aos antibióticos produzidos pelas actinobactérias.
As cepas de bactérias diazotrófias apresentaram dois tipos distintos de resistência aos antibióticos produzidos pelas actinobactérias: resistência intrínseca, que já foi discutida anteriormente e a resistência adquirida. A resistência adquirida ocorre quando as cepas suscetíveis tornam-se resistentes ao agente inibitório que eram suscetíveis (NAAMALA et al., 2016).
Os rizóbios ao crescerem sob a pressão seletiva (seleção natural) da ação antimicrobiana das actinobactérias, associado com tempo de geração desses microrganismos, resultaram na resistência adquirida por parte dessas cepas em um intervalo de tempo relativamente curto.
O sequenciamento genético das cepas utilizadas identificou uma espécie de Streptomyces spp. (UB26), uma espécie de Endobacter medicaginis (L91), uma espécie de Bradyrhizobium retamae (L94) e uma espécie de Burkholderia spp. (L98).
Esses resultados estão de acordo com aqueles encontrados por Brito et
al., 2015 que ao fazer a caracterização cultural e morfológica dessas cepas de
actinobactérias classificou a UB26 como sendo do gênero Streptomyces e também com Silva et al., 2014 e Feitoza et al., 2015 que caracterizaram culturalmente as cepas de bactérias diazotróficas classificando a cepa L94 como sendo do gênero
Bradyrhizhobium.
Os dados do sequenciamento divergiram com relação à cepa L91 que foi classificada como Burkholderia sp. No sequenciamento foi encontrada a espécie
nódulos de alfafa recentemente identificada e adicionada ao gênero (RAMÍREZ- BAHENA et al., 2013).
Vale ressaltar que os métodos de classificação baseados no sequenciamento da região 16S do DNAr são mais recentes e têm revelado novas espécies bacterianas. A classificação fenotípica apesar de muito útil tem sido substituída pelas técnicas moleculares para classificação desses microrganismos (PEREIRA et al., 2011; RAMÍREZ-BAHENA et al., 2013).
6 CONCLUSÃO
1. As actinobactérias inibiram as bactérias diazotróficas.
2. As cepas de actinobactérias UB10 e UB20 se destacaram das demais como potenciais antagonistas.
3. Os rizóbios exibiram resistência após seguidas exposições, à ação inibitória das actinobactérias antagonistas com destaque para as cepas L94, L89 e L83.
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