Técnica do EPG (Electrical Penetration Graph)

Diferente de insetos mastigadores, onde é possível se observar o comportamento alimentar visualmente, nos insetos sugadores tais atividades são de difícil observação, principalmente as mais relevantes. Isso porque, ocorrem internamente nos tecidos das plantas (WALKER, 2000). Portanto, técnicas especializadas são necessárias para avaliar essas atividades.

Por esse motivo surgiu à ideia do monitoramento eletrônico da alimentação, ainda na década de 60, em que McLean e Kinsey (1964, 1965) introduziram um método que permitiu monitorar de forma mais detalhada os eventos envolvidos na alimentação de insetos com aparelho bucal picador-sugador, tais como penetração dos estiletes e ingestão da seiva. Os primeiros monitores de EPG, utilizados no monitoramento de afídeos, usavam corrente alternada (AC), conhecidos como “monitores AC”. Esses monitores registram as oscilações de voltagem na interação inseto-planta por meio de baixas impedâncias de entrada (106 Ohms). Nessa época a técnica ficou conhecida como “sistema de monitoramento elétrico” (EMS - Electrical Monitoring System). Mais tarde novas versões do EPG surgiram, chamados de “monitores DC”, pois utilizam sistema de corrente contínua (DC), por exemplo, o monitor modelo Giga 8 desenvolvido pelo professor Fred Tjallingii (Figura 1A).

Figura 1 - Monitores de EPG utilizados na determinação do comportamento alimentar de insetos sugadores. monitor “EPG-DC” modelo Giga 8 desenvolvido por Fred Tjallingii (A). Monitor universal “EPG AC-DC” desenvolvido por Backus & Bennett (B).

Além disso, nesse novo sistema a impedância aplicada é maior (109 Ohms) (TJALLINGII, 1978). A partir de então, a técnica passou a ser conhecida como “gráfico de penetração elétrica” (EPG), convencionada por Tjallingii (1985a). Mais recentemente, Backus e Bennett (2009) desenvolveram um monitor universal chamado monitor EPG AC-DC, o qual permite aplicar ambas as correntes elétricas (AC e DC) e também múltiplas impedâncias de entrada (variando de 106 a 1013 Ohms) (Figura 1B). Além disso, um novo termo foi

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implementado na literatura, denominado eletropenetrografia, estabelecido pela Dra. Elaine Backus.

A técnica do EPG é empregada no estudo das interações entre insetos sugadores, seu aparelho bucal (estiletes) e as plantas hospedeiras. Ou seja, é possível monitorar o comportamento alimentar desses insetos em diferentes tecidos vegetais. O termo “comportamento alimentar” envolve inúmeras atividades, como locomoção exploratória sobre a superfície do hospedeiro, busca de novos sítios de alimentação, penetração dos estiletes e atividades associadas à ingestão de fluídos em diferentes tecidos vegetais (TJALLINGII, 2000).

Penetração dos estiletes é sinônimo do termo probing em inglês, o qual está relacionada com a inserção dos estiletes internamente na planta, e todas as atividades que ocorrem após sua inserção (como movimento dos estiletes, salivação, ingestão, etc). A técnica de EPG retrata todas essas atividades dos estiletes, e, portanto, abrange duas atividades básicas, penetração dos estiletes (probing) e não penetração dos estiletes (non-probing). Essa última engloba todos os comportamentos do inseto sobre o hospedeiro antes de iniciar a penetração dos estiletes, ou seja, quando fica parado ou caminhando sobre a superfície do hospedeiro (BACKUS et al., 2000).

O princípio básico da técnica é fazer de um inseto sugador e uma planta hospedeira parte de um circuito elétrico simples, onde uma determinada corrente elétrica circula pela interface inseto-planta, e essa corrente elétrica pode ser alternada (AC) ou contínua (DC) (TJALLINGII, 1978, 1988) (Figura 2).

Figura 2 - Diagrama ilustrativo do sistema de monitoramento eletrônico para estudos do comportamento alimentar de insetos sugadores.

O monitor de EPG é composto por uma fonte de voltagem (AC, DC ou ambas), de dois cabos, um de saída e outro de entrada, um resistor fixo ligado ao fio de entrada e um amplificador entre o inseto e o resistor (Figura 2) (Walker, 2000; TJALLINGII, 2006). Os amplificadores (canais), bem como os hospedeiros e os insetos, são mantidos dentro de uma gaiola de Faraday durante a gravação do comportamento alimentar, isso para proteger o sistema contra perturbações elétricas externas.

O cabo de saída é inserido na planta hospedeira por meio de um eletrodo de cobre (chamado eletrodo da planta), o qual pode ser inserido diretamente no tecido vegetal ou no substrato em que a planta se encontra (Figura 2). Já o cabo de entrada (chamado eletrodo do inseto), também associada a um eletrodo de cobre soldado a um pequeno prego de cobre, é conectado a um fino e flexível fio de ouro, que varia de 2,5 a 25 μm de diâmetro, de acordo com o tamanho do inseto. Esse fio é fixado no dorso do inseto sugador por meio de uma gota de cola condutiva, geralmente cola de prata, e então é conectado no EPG probe, chamado amplificador (Figura 3) (WALKER, 2000).

Figura 3 - Detalhe do amplificador e do eletrodo do inseto, o qual é colado a um fio de ouro e esse é colado no corpo do inseto por meio de uma gota de cola de prata condutiva (seta vermelha no detalhe), e em seguida é conectado no EPG probe (amplificador). Fonte: adaptado de Torsten Will, Institut Für Allgemeine Botanik.

O fio de ouro tem comprimento (± 3-4 cm) e flexibilidade suficiente para garantir que o inseto tenha total liberdade para explorar seu hospedeiro, não permitindo que o mesmo se enrole nas hastes e folhas da planta (WALKER, 2000). Além do mais, o comportamento do inseto é pouco afetado pela presença do fio (TJALLINGII, 1986).

Uma vez montado o circuito, quando o inseto insere seus estiletes nos tecidos vegetais esse circuito é fechado e um fluxo elétrico sai da fonte de energia, passa pelo hospedeiro, pelo inseto, pelo resistor de entrada e retorna a fonte de energia. Esse circuito simples é denominado circuito primário ou de mensuração (WALKER, 2000). A partir disso, é possível monitorar as atividades dos estiletes nos tecidos, pois a interação inseto-planta hospedeira atua no sistema como um resistor variável (TJALLINGII; GABRYS, 1999).

Essas atividades dos estiletes promovem alterações na condutividade elétrica do hospedeiro e dos canais salivar e de ingestão do inseto, além da variação da força eletromotriz (ou biopotenciais) produzida internamente no inseto ou na planta durante o processo alimentar (TJALLINGII, 1985a; WALKER, 2000). Com essas alterações, são gerados sinais elétricos distintos que são amplificados e capturados pelo monitor EPG e em seguida registrados em um gráfico de comprimento de ondas (TJALLINGII, 2006) (Figura 4).

Figura 4 - Formas de onda gravadas durante as atividades alimentares de pulgões. Fonte: Tjallingii (2006).

Por convenção, o nível de voltagem da planta é calibrado para que quando os estiletes são inseridos intercelularmente a voltagem do sistema é positiva e quando os estiletes são inseridos intracelularmente o sinal é, na maior parte das vezes, negativo (TJALLINGII, 2006). Por exemplo, na Figura 4 a maior parte dos sinais apresenta voltagem positiva, refletindo a atividade extracelular durante a atividade alimentar. Entretanto, durante o inserção e penetração dos estiletes nos tecidos (path) e na fase de floema, a voltagem é negativa (há uma queda de potencial) indicando penetração intracelular dos estiletes (punctura de células vivas).

As formas de onda registradas são descritas e diferenciadas de acordo com as seguintes características elétricas: frequência (Hz), amplitude (mínima e máxima), nível de voltagem (intra ou extracelular) e origem elétrica (resistência [R], força eletromotriz [emf] ou a mistura de ambas) (TJALLINGII, 1978, 1985a, 1985b, 1988; TJALLINGII; HOGEN ESCH, 1993).

Essas formas de onda estão associadas a diferentes atividades dos estiletes nos tecidos da planta. São três as principais atividades, 1) inserção dos estiletes e sua penetração (avanço dos estiletes nos tecidos da planta), 2) salivação (pré-alimentação) e 3) ingestão (alimentação) do conteúdo das células. Além disso, é possível correlacionar essas atividades com a posição dos estiletes nos tecidos vegetais e o tempo gasto em cada um desses tecidos (TJALLINGII 1985a, 1985b, 1988; KIMMINS; TJALLINGII, 1985; TJALLINGII; HOGEN ESCH, 1993; WALKER, 2000).

A principal aplicação do monitor EPG é a caracterização das atividades dos estiletes do inseto nos tecidos do hospedeiro, ou seja, suas atividades alimentares. A partir da

caracterização dessas atividades, outras linhas de pesquisa podem ser exploradas e mais bem compreendidas, sendo que as duas áreas mais empregadas são, estudos de resistência de plantas a insetos sugadores fitófagos (ALVAREZ et al., 2006; DIAZ-MONTANO et al., 2007; MARCHETTI et al., 2009; PEREIRA et al., 2010; GHAFFAR et al., 2011; RODRÍGUEZ-LÓPEZ et al., 2011; PHILIPPI et al., 2015) e no estudo da aquisição e transmissão de fitopatógenos (WAYADANDE; NAULT, 1993; MARTÍN et al., 1997; BACKUS et al., 2005a, 2009; MORENO et al., 2005; STAFFORD et al., 2009; BONANI et al., 2010; CEN et al., 2012; KRUGNER; BACKUS, 2014; LUO et al., 2015).

Além dessas, a técnica de EPG também tem sido uma ferramenta útil no estudo das