Técnica de heminested RT-PCR (hn RT-PCR)

A hn RT-PCR foi realizada segundo ALVES (2001).

A síntese de DNA complementar (cDNA), amplificação, heminested RT-PCR e eletroforese foram realizadas no Laboratório de Biologia Molecular da Disciplina de Zoonoses no Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública -FMVZ - UNESP/Botucatu.

Com o fragmento dos órgãos macerados, preparou-se uma suspensão a 20% com solução TRIS-EDTA-HCL (TE) (10 mM Tris - HCL e 1 mM EDTA, pH 7,8), sendo então esta suspensão de órgãos acondicionada em microtubos plásticos e congeladas à -20° C até o momento da análise. Os materiais foram descongelados aos poucos e seguiram-se os protocolos:

Protocolo de Extração de RNA

Homogeneizou-se 600 microlitros de Trizol® a 200 microlitros de suspensão de órgãos preparada a 20% em TE

Incubou-se a suspensão a temperatura ambiente (15 - 30º C) por 5 minutos

Adicionou-se 200 microlitros de clorofórmio e homogeneizou-se em vórtex por 15 segundos

Incubou-se por 10 minutos em temperatura ambiente Centrifugou-se a 12000g / 5 minutos a 4 º C

Transferiu-se a base aquosa para outro tubo (foram retirados 3 vezes o conteúdo de 160 microlitros)

Adicionou-se 480 microlitros de álcool isopropílico

Homogeneizou-se por inversão 5 vezes e depois em vórtex por 15 segundos

Incubou-se a temperatura ambiente por 10 minutos Centrifugou-se a 12000g / 15 minutos a 4º C

Desprezou-se o sobrenadante

Lavou-se o sedimento com 1,0 mL de etanol 75% Homogenizou-se em vórtex por 15 segundos Centrifugou-se a 7500g / 5 minutos a 4º C

Desprezou-se o conteúdo do microtubo cuidadosamente para não desprezar o “pellet” formado no fundo do tubo

Secou-se o sedimento por 5 a 10 minutos

Ressuspendeu-se em 15 microlitros de água DEPC autoclavada Incubou-se em banho-maria a 56º C por 10 minutos

Protocolo de Síntese de DNA complementar (cDNA)

Inicialmente aqueceu-se no termociclador a 95º C por 5 minutos, 7 microlitros de amostra de RNA extraído, para facilitar a ação da enzima transcriptase reversa, que foi adicionada às amostras. Preparou-se então o MIX para reação, constituído por:

4 microlitros de solução tampão (5 vezes concentrado) 2 microlitros de dNTP (10 milimolar)

2 microlitros de “primer” 505 (10 pmol/µ) 2 microlitros de “primer” 937 (10 pmol/µ) 2 microlitros de DTT (10 milimolar) 1 microlitro de RT (200 u/µ)

Distribuíram-se 13 µL desta mistura nos microtubos com cada amostra aquecida, totalizando 20 µL e incubou-se a 42º C por 60 minutos no termociclador

Protocolo para a Amplificação de cDNA

Para a amplificação do cDNA o mix de cada reação foi composto por:

25,25 microlitros de água mili-Q 8 microlitros de dNTP (1,25 milimolar) 5 microlitros de tampão para PCR

2,5 microlitros de “primer” 505 (10 pmol/µL) 2,5 microlitros de “primer” 937 (10 pmol/µL)

1,5 microlitros de MgCl2 (50 milimolar)

0,25 microlitros de Taq polimerase

Adicionaram-se 5 microlitros de cada amostra em 40 microlitros do mix.

No termociclador as amostras foram submetidas aos seguintes ciclos:

Desnaturação inicial: 94º C por 3 minutos

Os ciclos de desnaturação, hibridização e extensão foram repetidos 35 vezes sendo:

Desnaturação: 94º C por 45 segundos Hibridização: 55º C por 1 minuto Extensão: 72º C por 10 minutos

As amostras foram submetidas a um ciclo de extensão final de 72º, por 10 minutos, e mantidas a 4º C para realização do hn RT- PCR.

Protocolo para a hn RT-PCR

Para realização do hn RT-PCR o mix foi constituído de:

25,25 microlitros de água mili-Q 8 microlitros de dNTP (1,25 milimolar) 5 microlitros de tampão para PCR

2,5 microlitros de “primer” 505 (10 pmol/µL) 2,5 microlitros de “primer” 779 (10 pmol/µL)

1,5 microlitros de MgCl2 (50 milimolar)

0,25 microlitros de Taq polimerase

Distribuíram-se 45 microlitros desta mistura nos microtubos e adicionaram-se 5 microlitros de cada amostra de cDNA amplificado.

No termociclador as amostras foram submetidas as seguintes etapas:

Desnaturação inicial: 94º C por 3 minutos

Os ciclos de desnaturação, hibridização e extensão foram repetidos 25 vezes sendo:

Desnaturação: 94º C por 45 segundos Hibridização: 55º C por 1 minuto Extensão: 72º C por 10 minutos

As amostras foram submetidas a um ciclo de extensão final de 72º por 10 minutos.

Os produtos amplificados foram conservados a 4º C até o momento da eletroforese, realizada em cuba horizontal contendo tampão borato EDTA (TBE) 0,5x (0,04M tris-borato e 1 mM de EDTA, pH 8,0) em gel de agarose a 1,5 % (p/v) e submetidos à corrida eletroforética a 100V por 1:20 hora. Os produtos amplificados foram visualizados no transiluminador, sob luz ultravioleta e fotografados com FCR-10 câmara/Fotodyne, com filme Polaroid 667, asa 3000.

3.3. Delineamento Experimental

Foram inoculados, por via intramuscular, com 0,03 mL de

uma suspensão a 10–2.3 de vírus rábico de rua, 150 camundongos de 30

dias de idade. Grupos de 5 animais foram sacrificados às 3, 6, 12, 24, 48, 72, 96 horas e 5, 7, 10, 14, 17, 21, 25 e 30 dias pós-inoculação.

De cada animal sacrificado foram colhidos partes dos músculos dos membros anteriores direito (MAD) e esquerdo (MAE),

músculos dos membros posteriores direito (MPD) e esquerdo (MPE), bexiga, rins direito (rim D) e esquerdo (rim E), fígado, baço, pulmão, glândula salivar, língua, cérebro e medula. Estes materiais foram divididos em 3 fragmentos, acondicionados em tubos plásticos (tipo Eppendorf®) e processados de acordo com a técnica diagnóstica a que foram submetidos.

Para a reação de IFD os fragmentos foram envolvidos em talco cirúrgico, congelados em nitrogênio líquido e submetidos a cortes histológicos de congelamento e mantidos em lâminas a -20° C, até a realização da técnica.

Para a IC os fragmentos, de cada animal, foram congelados a -20° C e aos poucos foram macerados individualmente em graals, com diluente viral. Em seguida, foram centrifugados e as suspensões inoculadas via intracerebral em camundongos de 21 dias, visando o reisolamento do vírus rábico.

Para a técnica de hn RT-PCR os fragmentos foram congelados a -20°C, logo após terem sido colhidos, e depois foram macerados individualmente em graals com tampão TE, no momento da realização da técnica.

Foi realizado “pool” das suspensões dos órgãos, no momento da realização da técnica de hn RT-PCR, agrupando-se aleatoriamente dois e três materiais, entre os cinco colhidos.

3.4. Análise Estatística

A análise estatística foi realizada utilizando o método Kruskal - Wallis por meio do software “GraphPad Instat versão 3.00 para Windows 95”.

Foram analisados comparativamente os resultados obtidos pelas três técnicas nos diferentes órgãos e tempos, assim como os resultados de cada técnica entre os vários órgãos nos diferentes tempos de colheita, considerando-se p< 0,05.

RESULTADOS

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4. RESULTADOS

4.1. Sintomatologia clínica

Os camundongos inoculados, por via intramuscular, apresentaram sintomatologia clínica a partir do 11º dia pós-inoculação, onde foram observadas paralisia de membros posteriores, apatia e incoordenação (Figura 1) e morte, evidenciados até o 17º dia pós- inoculação.

Ao serem necropsiados para a retirada dos órgãos observou-se presença de retenção urinária, com aumento da bexiga. Os cérebros apresentavam-se congestos e degenerados, tendo uma aparência amolecida.

FIGURA 1. Camundongo apresentando paralisia de membros

posteriores após a inoculação intramuscular com vírus rábico de rua. Botucatu, 2003.

4.2. Resultados da IFD

As reações positivas foram caracterizadas pela presença corpúsculos de Negri no tecido analisado (Figura 2) e as negativas por ausência de fluorescência.

Os resultados obtidos na leitura das lâminas submetidas a IFD nos cortes de congelamento estão apresentados na Tabela 1.

Não foram observados resultados positivos na IFD em todos os tecidos dos vários animais examinados até o 7° dia pós- inoculação.

Ao 10º dia pós-inoculação foram observados 40% de resultados positivos na IFD, em cérebro, medula e glândula salivar. No 14º dia, 80% de positividade foi obtida em cérebro e glândula salivar, seguida de 40% de materiais positivos em medulas e 20% em rim D, fígado, baço e língua.

No 17º dia pós-inoculação foi verificada 40% de positividade em cérebro, medula e glândula salivar e 20% em língua. No 21º dia pós-inoculação foram obtidos 60% de resultados positivos em cérebros, medula e glândula salivar e ausência de positividade nos demais órgãos.

No 25º dia e no 30º dia pós-inoculação foram obtidos 80% de positividade em cérebro com ausência de resultados nos demais órgãos e tecidos.

FIGURA 2. Resultado positivo de Imunofluorescência direta de tecido

cerebral de camundongos inoculados experimentalmente com vírus rábico. Botucatu-2003.

rábico e sacrificados nos diferentes tempos pós-inoculação. Resultados apresentados em nº de materiais positivos / nº de materiais avaliados (positividade %). Botucatu, 2003.

IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA

MATERIAIS/

TEMPOS MEDULA BEXIGA RIM D RIM E FÍGADO BAÇO PULMÃO CÉREBRO GL.SALIVAR MPD MPE MAD MAE LÍNGUA

3h 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 6h 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 12h 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 24h 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 48h 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 72h 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 96h 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 5d 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 7d 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 10d 2/5 (40%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 2/5 (40%) 2/5 (40%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 14d 2/5 (40%) 0/5 (0%) 1/5 (20%) 0/5 (0%) 1/5 (20%) 1/5 (20%) 0/5 (0%) 4/5 (80%) 4/5 (80%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 1/5 (20%) 17d 2/5 (40%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 2/5 (40%) 2/5 (40%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 1/5 (20%) 21d 3/5 (60%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 3/5 (60%) 3/5 (60%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 25d 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 4/5 (80%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 30d 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 4/5 (80%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) MPD = membro posterior direito MPE = membro posterior esquerdo MAD = membro anterior direito MAE = membro anterior esquerdo