A etapa de laboratório para recuperação de Grãos de amido e Fitólitos foi aplicada a metodologia apresentada a seguir:
MATERIAIS
Almofariz com pistilo;
Balança analítica de precisão;
Béquer;
Conta gotas;
Estante de tubos de ensaio; Pisseta; Pipeta volumétrica; Eppendorf; Isqueiro; Água bidestilada; Cloreto de césio; Centrífuga; Laminas; Palito de madeira; Glicerol;
Esmalte base incolor; Etiqueta adesiva;
Bastão de escavador SSW odontológico. MÉTODOS
Cada amostra contida em eppendorf é pressionada com um bastão feito de escavador SSW odontológico aperfeiçoado para triturar amostras de grãos maiores, na intenção de diminuição granulométrica da amostras, onde contribui na flotação dos amidos e posição na lamina, o bastão é esterilizado com água bidestilada, fogo e novamente água bidestilada, depois enxugado com papel toalha, posteriormente, adicionado 0,50 ml de cloreto de césio (CsCl D = 1,9g/cm3) com uma pipeta volumétrica, para que possa ocorrer a flotação e densidade dos grãos de amido a superfície durante a centrifugação, para isso é necessário que a amostras esteja homogênea.
Após as amostras serem pesadas em uma balança analítica (modelo Adventurer – OHAUS AR3130) e colocadas proporcionalmente na centrífuga (modelo Hermle) de forma bem distribuída para equilíbrio de peso, com RPM 3.000 durante 20 minutos. As amostras são retiradas da centrífuga e transferido do primeiro eppendorf para um segundo eppendorf com uma concentração de cloreto de césio de 1,9 g/cm3. Após a transferência do conteúdo para o novo eppendorf, adiciona água bidestilada para que os amidos se concentrem no fundo do recipiente.
Posteriormente é realizada a agitação da amostra e colocada para centrifugação com as mesmas aplicações metodológicas anteriores em que são pesadas na balança de precisão e equilibradas na centrífuga, que durante a segunda remessa de centrifugação está programada para 4.000 RPM durante 20 minutos para densidade dos amidos.
As amostras são retiradas após 20 minutos de centrifugação, com uma pipeta volumétrica descartável (Figura 28) é retirado todo o conteúdo de água bidestilada da amostra e adicionada em seguida outra remessa de água bidestilada à amostra, para maior densidade dos amidos. Novamente as amostras são equilibradas por duplas na balança analítica (Figura 29), e colocadas na centrífuga de forma proporcionalmente bem distribuídas, para que possa novamente sofrer uma segunda rotação de 4.000 RPM durante 20 minutos.
As 14 amostras de cálculos dentários selecionadas para extração de amidos, após a centrifugação, são retiradas 1,5 ml de água bidestilada com uma pipeta volumétrica descartável, em sequência, são preparadas as lâminas.
Para a preparação das lâminas são realizadas o preenchimento dos dados na etiqueta adesiva, para cada amostra foram preparadas duas laminas, como melhor forma de distribuição do conteúdo. Primeiro a amostra é agitada, depois com uma pipeta a amostra é retirada do eppendorf e aplicada na lâmina, em seguida com um palito de madeira aplica uma pequena gota de glicerol na amostra, onde mexe o conteúdo até ficar homogêneo e cobre com uma placa de acrílico onde é fixada com esmalte base incolor e posta para secar durante 24h. após esse tempo, a amostra pode ser observada no microscópio (modelo Olympus BX53 a 1280x). Para análise dos amidos, com uma câmera acoplada ao notebook, pode-se observar as amostras com quatro focos de luz:
1. Luz rosa – polarização, permite observar forma e dimensão dos amidos;
2. Luz negra – campo escuro em que permite a observação da cruz de extensão ou cruz de malta de cada amido;
3. Luz branca – ou campo branco, permite observar os anéis de crescimento da amostra, fissuras, facetas e o perímetro do grão de amido;
4. DIC – permite a visualização volumétrica do grão de amido.
TÉCNICA
Os grãos de amido são grânulos microscópicos que servem como um mecanismo principal no armazenamento de energia dos vegetais, encontrados normalmente em plantas superiores. E os estudos destes grãos nos permite inferir sobre o comportamento alimentar de um determinado grupo pretérito como é o caso em estudo, em que podemos observar os vegetais consumidos pelo grupo que
habitou a Toca da Baixa dos Caboclos na Serra da Capivara há aproximadamente 360+- a 280+- anos BP.
COLEÇÃO DE REFERÊNCIA DA UNAM
Como as análises foram realizadas na UNAM – México, primeiramente utilizamos a coleção de referência local, mas que havia em comum na América, como grãos de trigo e fava. Para isto, em laboratório foi usado um Almofariz com pistilo lavado com água e sabão, em seguida com água bidestilada fervendo e após esperar 5 minutos para esfriar foi esterilizado com álcool e seco com papel toalha. Em outro recipiente é colocado o grão de molho em água bidestilada por 24h para amolecimento do grão.
Posteriormente coloca a amostra de referência no recipiente esterilizado e tritura o grão até que a massa interna esteja pronta para manipulação com um palito de madeira. Em que, com o palito, é aplicada uma mínima quantidade na lâmina e adicionada glicerol, onde posteriormente cobre a amostra com uma placa de acrílico e lacra com esmalte base incolor (Figura 30) onde é posta para secar e no dia seguinte é feita a observação em microscópio.
Figura 28: Preparação das amostras para identificação de grãos de amido
Figura 29: Centrifugação das amostras para identificação de grãos de amido
Fonte: Carvalho, 2018.
Figura 30: Preparação das amostras de coleção de referência de grãos de amido
Fonte: Carvalho, 2018.
Fitólitos em Cálculos dentários
Os fitólitos são partículas de sílica hidratada que se formam durante o crescimento da planta, estes por sua vez são liberados quando a planta morre ou se decompõe. Assim, estes corpos microscópicos formados nos espaços celulares das plantas absorvem água na qual se encontra dissolvida sílica sob a forma de ácido monosilícico (PIPERNO & PEARSALL, 1993).
Esta sílica é então depositada dentro da planta através de dois mecanismos distintos de acumulação que acontece através da formação de fitólitos dentro de células especializadas e acumuladoras de sílica (idioblastos), ou da segunda forma, depositada nos espaços celulares e intercelulares das plantas (PEARSALL, 2000).
O estudo arqueológico de fitólitos tomou a partir de trabalhos como os de Deborah Pearsall (2000) e Dolores Piperno (1988,1998) trazendo uma ferramenta imensa em estudos arqueológicos para conhecimento dos grupos pretéritos e sua interação com o meio vegetal. Através desses estudos, foi possível observar que os Fitólitos são feitos de sílica, portanto são partículas inorgânicos, não são sujeitos a decomposição por microrganismos, que junto com o intemperismo em climas tropicais (caso do presente estudo) são os maiores destruidores de amostras. Com isso, os fitólitos muitas vezes são a única fonte de informação sobre plantas ou ambientes pretéritos existentes em contextos arqueológicos.
Casos como fitólitos que foram observados em sedimentos tão antigos como àqueles encontrados em amostras dos períodos Devoniano, Permiano e Triássico (CARTER, 1999 apud CASCON, 2009), comprovam que os estudos deste microvestígio tornam-se uma ferramenta eficaz para reconstruções paleoambientais até em períodos bastante recuados da história da Terra.
É importante destacar, como afirma (LUZ et al., 2015) que a taxa de produção de fitólitos também é diferente de acordo com a estrutura vegetal estudada, o autor afirma que as partes aéreas como as folhas, geralmente apresentam maiores taxas de produção de fitólitos, oposto as partes mais baixas como as subterrâneas (raízes) que produzem menos fitólitos.
Desta maneira, as famílias com maior produção de fitólitos são, por exemplo, as gramíneas (Poaceae) e a das palmeiras (Arecaceae), com fitólitos bastante distintos. Já as trepadeiras como inhame (Dioscoreaceae), são consideradas como baixas produtoras de fitólitos, sendo estes também de baixa significância taxonômica (PIPERNO & PEARSALL, 1993; PIPERNO, 2006; CASCON, 2009).
As amostras arqueológicas dos vestígios de remanescentes humanos destinados a identificação de fitólitos foram examinadas no Laboratório de Investigações Antropológicas na Universidad Autónoma do México - UNAM / México, onde foram identificados dois tipos de fitólitos relacionados a apenas duas (02) famílias (bilobado e Arecaceae).
Houve uma grande dificuldade de identificação de fitólitos nas amostras de pele e de cálculo dentário, estes últimos não apresentaram grande proporção de fitólitos, ao contrário de grãos de pólen e de grãos de amido. O uso dos fitólitos se torna essencial em estudos de clima e vegetação, uma vez que esses bioindicadores podem fornecer tanto dados paleoambientais, cobertura vegetal de uma determinada área, distinção entre gramíneas C3 e C4 e ajuda a compreender o ambiente de forma mais segura, uma vez que os fitólitos não sofrem transporte como os grãos de pólen (Lu & Liu 2003). Em laboratório, as atividades de recuperação e identificação de fitólitos foram metodologicamente trabalhamos da seguinte maneira.