2.7.1. PCR qualitativa
Numa primeira fase, procedeu-se à avaliação da capacidade de amplificação do ADN e simultaneamente a detecção de um gene de referência da espécie, a lectina da soja. Para tal, testaram-se e optimizaram-se 3 pares de primers para a lectina da
soja (Tabela 12).
Em todos os extractos onde foi possível detectar o gene da lectina, procedeu- se à detecção específica da soja RR por PCR, para a qual se testaram e optimizaram as condições com 2 pares de primers (Tabela 12). Todos os primers foram
sintetizados por MWG-BIOTECH AG (Ebersberg, Alemanha).
Tabela 12 – Primers usados na PCR Qualitativa.
Espécie
Alvo Primers Sequências 5’ – 3’ Gene Alvo
Amplificão
(pb) Referência
LE1 CAA AGC AAT GGC TAC TTC AAA G
Soja
LE2 TGA GTT TGC CTT GCT GGT CAG T
Lectina 103 Mafra et al.,
2008a
LE3 GCA AAG CAA TGG CTA CTT CAA
Soja
LE4 AAG AAA CAG TTT CCG CTG AGT T
Lectina 120 Mafra et al.,
2008a
GM03 GCC CTC TAC TCC ACC CCC ATC C
Soja
GM04 GCC CAT CTG CAA GCC TTT TTG
TG
Lectina 118 Somma et al.,
2006
GM07 ATC CCA CTA TCC TTC GCA AGA
Soja RR
GM08 TGG GGT TTA TGG AAA TTG GAA
CP4 EPSPS 169 Somma et al.,
2006 RRS-3J1 GCA TCT ACA TAT AGC TTC TCG
TTG Soja RR
RRS-3J3 AAC TTCTCG ACG ATG GCC G
NOS 3’UTR/planta 106 Mafra et al., (dados não publicados) a
Número de acesso Genebank AJ308515.
Todas as reacções utilizaram um volume total de 25 µL, cujos componentes se apresentam na Tabela 13 para as amostras de grão de soja e na Tabela 14 para as amostras de óleos.
Os programas de tempo/temperatura utilizados no termociclador PTC-100 (MJ, Inc., Watertown, MA, EUA) optimizados para cada reacção de PCR apresentam-se na Tabela 15.
Tabela 13 – Componentes da PCR envolvidos na amplificação de amostras de grão de soja. Volume (µL) Lectina RR Componente GM03/GM04 GM07/GM08 Água ultrapura 15,05 13,8 Tampão 10x 2,5 2,5 MgCl2 (25 mM) 1,25 2 dNTP (2,5 mM cada) 2 2 Primers (10 mM cada) 1 1,25
Taq Polimerase (5U/µL) 0.2 0.2
Amostra de ADN 2 2
Volume total 25 25
Tabela 14 – Componentes da PCR envolvidos na amplificação de amostras de óleos de soja.
Volume (µL) Soja Soja RR Componente LE1/LE2 LE3/LE4 GM03/GM04 GM07/GM08 RRS-3J1/RRS-3J3 Água ultrapura 11,8 11,8 13,05 11,8 12,3 Tampão 10x 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 MgCl2 (25 mM) 2 2 1,25 2 2 dNTP (2,5 mM cada) 2 2 2 2 2 Primers (10 mM cada) 1,25 1,25 1 1,25 1
Taq Polimerase (5U/µL) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Amostra de ADN 4 4 4 4 4
Volume total 25 25 25 25 25
Os fragmentos de ADN obtidos por PCR foram analisados por electroforese, utilizando-se um gel de agarose a 2,0% em tampão TAE 1x (0,04 M de Tris-Acetato, 0,001 M de EDTA) durante cerca de 1h a 120 V. Em cada electroforese utilizaram-se 5 µL de marcador de massa molecular com 10 bandas de 100-1000 pb, num dos poços do gel aplicado juntamente com 4 µL de corante de carregamento (6x). Cada amostra foi aplicada na quantidade de 10 µL de extracto das amostras de grão e 20 µL de
extracto das amostras de óleo, para cada um dos poços do gel conjuntamente com o corante de carregamento.
Tabela 15 – Condições de tempo e temperatura utilizadas na PCR qualitativa Espécie
alvo Soja Soja RR
Primers LE1/LE2 LE3/LE4 GM03/GM04 GM07/GM08 RRS-3J1/ RRS-3J3
Passos Temp. Tempo Temp. Tempo Temp. Tempo Temp. Tempo Temp. Tempo
Desnaturação 94ºC 4 min 94ºC 4 min 95ºC 5 min 95ºC 5 min 94ºC 4 min
Amplificação 94ºC 30 s 94ºC 30 s 95ºC 30 s 95ºC 30 s 94ºC 30 s
60ºC 30 s 60ºC 30 s 65ºC 30 s 55ºC 30 s 60ºC 30 s
72ºC 30 s 72ºC 30 s 72ºC 1 min 72ºC 1 min 72ºC 30 s
Nº de ciclos 35 35 37 35 38
Extensão
final 72ºC 4 min 72ºC 4 min 72ºC 5 min 72ºC 5 min 72ºC 4 min
A revelação do gel efectuou-se por imersão deste numa solução de brometo de etídio (0,4 µg/mL) durante cerca de 5 minutos, seguida de remoção do excesso de corante por imersão do gel em água durante cerca de 30 minutos. O gel de agarose foi visualizado através de um transluminador com luz UV obtendo-se o seu registo por imagem digital com o aparelho Kodak Digital ScienceTM DCI20 (Rochester, NY, EUA).
2.7.2. PCR em tempo real
A técnica de PCR em tempo real teve também como objectivo detectar a lectina da soja e a soja RR.
A técnica baseou-se na metodologia descrita na ISO 21570 (2005) para a detecção quantitativa da soja RR por PCR em tempo real com algumas alterações. A técnica consistiu na utilização de sondas de hidrólise do tipo TaqManTM cujas sequências se apresentam na Tabela 16, juntamente com os respectivos primers para
a lectina da soja e para a construção específica da soja RR.
A amplificação por PCR em tempo real foi efectuada num volume de reacção de 20 µL, contendo 2 µL de extracto de ADN no caso das amostras de grão de soja e 4 µL no caso de extractos de óleos. Todas as reacções continham de 10 µL de iQTM Supermix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA) 1x, 900 nM de cada primer e 100
nM de cada sonda (Tabela 17). As reacções foram efectuadas num termociclador em tempo real iCycler iQTM Multicolor Real-Time Detection System (Bio-Rad Laboratories, Hércules, CA, EUA) utilizando-se as seguintes condições: 1 minuto a 95ºC; 50 ciclos de 30 segundos a 95ºC e 1 minuto a 60ºC, com a detecção de fluorescência no final de cada ciclo. Os dados obtidos foram processados com o auxílio do software Optical System versão 3.1 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA). Todas as amostras foram amplificadas em triplicado para cada um dos alvos, em cada ensaio de PCR em tempo real.
Tabela 16 – Primers e sondas utilizados em PCR em tempo real.
Espécie Primers e Sondas Sequências 5’ – 3’ Gene Alvo Amplificão (pb) Referência
Lectin-F TCC ACC CCC ATC CAC ATT T Lectin-R GGC ATA GAA GGT GAA GTT GAA
GGA Soja
Lectin-TMP FAM-AAC CGG TAG CGT TGC CAG CTT CG-BHQ2
Lectina 81 ISO 21570
RRS-F GCC ATG TTG TTA ATT TGT GCC AT
RRS- R GAA GTT CAT TTC ATT TGG AGA GGA
C Soja RR
RRS-TMP FAM-CTT GAA AGA TCT GCT AGA
GTC AGC TTG TCA GCG-BHQ2
Junção
CTP/35S 83 ISO 21570
FAM – 6-Carboxifluoresceina, BHQ2 – Blackhole Quencher 2
Tabela 17 – Componentes utilizados no PCR em tempo real. Volume (µL)
Amostras Sólidas Amostras Líquidas Componente Lectina RR Lectina RR Água ultrapura 4,2 4,2 2,2 2,2 iQTMSuperMix 10 10 10 10 Primers 1,8 1,8 1,8 1,8 Sondas 0,2 0,2 0,2 0,2 ADN 2 2 4 4 Volume total 20 20 20 20