2.8.1 Cromatografia Gasosa Monodimensional (GC/MS) e Cromatografia Gasosa Olfatométrica (GC-O)
Cerca de 800 compostos voláteis, pertencentes a distintas classes químicas e presentes em diversificadas concentrações, já foram identificados em vinhos, sendo a técnica de cromatografia gasosa, acoplada aos detectores FID ou MS, a mais comumente utilizadas para tal estudo.102
A cromatografia é uma técnica que se baseia na distribuição dos componentes de uma amostra a ser separada, em duas fases, uma estacionária e a outra, móvel. A cromatografia gasosa (GC), é o resultado de repetidos processos de sorção e dessorção dos componentes da amostra ao longo da fase móvel, que é um gás inerte, cuja função é transportar a amostra ao longo do processo, sendo geralmente empregados os gases hélio, nitrogênio ou hidrogênio.14
Embora a GC seja uma técnica que visa separar, identificar e quantificar de forma rápida e eficiente os constituintes de uma mistura, ela sozinha, não é capaz de analisar compostos odoríferos presentes nos vinhos. Sendo assim, complementarmente à identificação dos voláteis por técnicas de GC, torna-se necessária a utilização de técnicas que associem a cromatografia à olfatometria, conhecidas como GC-Olfatométrica ou GC-O.15 Os métodos de GC-O consistem na avaliação sensorial dos compostos voláteis presentes no eluente cromatográfico assim que os mesmos deixam a coluna, e são comumente classificados em quatro categorias: diluição, tempo-intensidade, frequência de detecção e intensidade a posterior.
As análises de diluição se baseiam em diluições sucessivas do isolado até o odor não ser mais percebido pelos membros do painel olfativo. Este método utiliza geralmente um pequeno
28 número de julgadores treinados e é representado por CHARM103 e AEDA.104 Na AEDA as amostras são avaliadas em ordem crescente de diluição e o impacto de um composto odorífero é dado pelo fator de diluição (FD), que representa a maior diluição do isolado na qual o composto volátil ainda pode ser detectado. Uma das maneiras de apresentar os dados é na forma de um aromagrama, de FD versus tempo de retenção. Na CHARM as diluições são apresentadas de forma aleatória, evitando possíveis tendências nos resultados, introduzidas pelo conhecimento das diluições. Os membros do painel registram o início e o fim de cada odor detectado e assim é gerado um aromagrama para cada julgador, através da representação gráfica da duração da sensação do odor em relação ao valor de diluição. Os métodos de diluição apresentam como desvantagens longos tempos de análise, de modo que participam dessas análises um pequeno número de avaliadores, aumentando a probabilidade de obtenção de resultados de baixa precisão. Além disso, os resultados dependem do limiar de detecção sensorial dos analitos, e não da intensidade real do odor do analito em uma dada amostra.105
A técnica de OSME106, empregada neste trabalho, se baseia no método tempo- intensidade, no qual cada julgador avalia o eluente cromatográfico e registra em uma escala associada a um computador, a intensidade e o tempo de duração de cada estímulo olfativo percebido. Os dados gerados são analisados por um software que gera um aromagrama, no qual cada um dos picos representa um estímulo olfativo sentido pelos julgadores no decorrer da análise. Picos altos e com áreas maiores representam compostos de maior importância para o aroma e sabor do produto analisado. Apresenta como desvantagem a necessidade de uma equipe treinada para a realização das análises.105
Por outro lado, as técnicas de Análise Olfatométrica Global (OGA)107 e de Frequência de Impacto Nasal (NIF/SNIF), estão baseadas na frequência com que os julgadores detectam a presença dos voláteis no eluente cromatográfico, ou seja, quanto maior o número de detecções de um determinado composto, maior será sua importância para o aroma de uma determinada amostra. Um dos benefícios dos métodos de frequência de detecção é a sua simplicidade, não sendo necessário o preparo de avaliadores para realizar as análises. Esses métodos são os que consomem menos tempo e os mais fáceis de conduzir, no entanto o resultado obtido relaciona- se apenas com a intensidade do odor detectado a uma determinada concentração do analito na amostra, que é a principal limitação deste grupo de métodos.105
Os métodos de intensidade posterior se baseiam na avaliação da intensidade de um composto volátil após seu aroma ser totalmente percebido por uma equipe de julgadores. Neste
29 método, após sentir o composto, o julgador associa a sua percepção a uma escala numérica, previamente memorizada, e ao mesmo tempo, descreve a qualidade do odor sentido.108
2.8.2 Cromatografia Gasosa Bidimensional Abrangente (GC×GC)
A GC×GC é uma técnica que consiste da combinação de duas colunas capilares de diferentes mecanismos de retenção, conectadas em série, sendo a coluna da primeira dimensão (1D) de tamanho convencional, ou seja, comumente de 30 m. A coluna da segunda dimensão (2D), deve ser mais curta, do tipo empregado em cromatografia rápida (fast GC), para que o perfil de separação alcançado na 1D seja mantido.109 Entre as duas colunas existe um modulador, considerado uma das partes mais importantes do sistema, que é responsável por amostrar a banda cromatográfica que elui da 1D, redirecionando-a periodicamente para a 2D. O modulador, ao focalizar o eluente proveniente da primeira coluna e introduzi-lo na segunda dimensão, deve fazê-lo em uma frequência adequada de amostragem para que a resolução cromatográfica obtida na primeira separação seja mantida. O ideal é que a amostragem proveniente da 1D seja de 3 a 4 fatias por pico, permitindo assim, manter a separação obtida na primeira coluna. O período de amostragem corresponde ao período de modulação (PM), que é a duração de um ciclo completo de separação. Sendo assim, o tempo de separação na segunda coluna, que dura em torno de 2 a 10 segundos, é essencialmente isotérmico.110
O termo “abrangente” relaciona-se ao fato de que todo eluente da primeira dimensão, ou parte representativa do mesmo, seja introduzido na segunda dimensão, sem perder as características da separação obtida na 1D. Na separação abrangente, alguns fatores devem ser verificados, tais como: (a) se todos os constituintes da amostra estão sujeitos a duas separações de mecanismos distintos; (b) se os constituintes da amostra separados na 1D seguirão separados na 2D; e (c) se o perfil de eluição de ambas colunas é mantido.111
Um sistema é considerado ortogonal quando os mecanismos de separação que ocorrem em ambas as colunas são independentes, ou seja, as mesmas devem ter fases estacionárias diferentes. Sendo assim, se a coluna empregada na 1D for apolar, a separação ocorrerá em função da volatilidade, tornando necessária a escolha de uma coluna de fase estacionária de média ou elevada polaridade para uso na 2D, onde a separação se dará por polaridade. A eficiência de uma separação cromatográfica bidimensional depende do tipo de amostra, assim como do conjunto de colunas empregado na primeira e segunda dimensão, e não, necessariamente, da ortogonalidade do sistema. No entanto, nota-se na prática, uma relação da ortogonalidade do sistema com o aumento da capacidade de pico, que é o número máximo de
30 compostos colocados lado a lado em um espaço de separação com uma dada resolução em um determinado intervalo de tempo.111
A GC×GC, assim como a GC/MS, fornece informações qualitativas e quantitativas, no entanto, a representação gráfica se dá de forma diferenciada. Softwares específicos são utilizados para gerar os gráficos tridimensionais, onde o eixo X representa a separação ocorrida na 1D, o eixo Y a separação na 2D e um terceiro eixo, o Z, representa a intensidade do sinal gerado por um sistema cromatográfico bidimensional abrangente.
O detector para ser empregado em GC×GC deve apresentar rapidez na velocidade de aquisição dos dados, sendo que esta velocidade se relaciona com a rapidez no processo físico- químico que irá produzir o sinal, assim como a rapidez no processamento eletrônico deste sinal. Desse modo, o detector deve ser pequeno e apresentar taxa de aquisição de dados de pelo menos 50 Hz, evitando o alargamento de pico por volume extra coluna e reconstrução incorreta do pico, respectivamente. Sendo assim, os sistemas de detecção mais utilizados são o detector de ionização em chama (FID) e o detector de espectrometria de massas por tempo de voo (TOFMS).112
O uso da GC×GC apresenta algumas vantagens com relação à GC/MS, tais como o aumento da detectabilidade, devido ao estreitamento das bandas cromatográficas decorrente do processo de modulação, aumento da capacidade de pico, a separação da amostra se dá por dois processos distintos, estruturação observada em alguns cromatogramas obtidos por GC×GC auxilia na identificação de compostos desconhecidos.16
Essas e outras características fazem da GC×GC uma técnica apropriada para a análise de matrizes complexas, assim como de outras amostras, onde a GC/MS é incapaz de fornecer uma separação razoável. Por consequência, a GC×GC é uma técnica analítica adequada para a análise de compostos responsáveis pelo aroma dos vinhos e espumantes.