Os ensaios in vivo envolvendo a produção animal e a digestibilidade são os métodos mais precisos para determinar o valor nutricional dos alimentos. Entretanto, o custo financeiro destes estudos é elevado, pois requerem o uso de animais, grande quantidade de alimentos, mão-de-obra e tempo, tornando-se laboriosos e dispendiosos. Com o intuito de superar essas limitações às metodologias in vitro de avaliação de alimentos foram desenvolvidas e têm se tornado cada vez mais populares, viabilizando o estudo de grande número de amostras simultaneamente e permitindo rápida obtenção de resultados. As técnicas in vitro que utilizam microrganismos e/ou enzimas buscam reproduzir as condições do trato digestivo dos ruminantes. Elas são relativamente simples de serem executadas e apresentam baixo custo, com boa acurácia e alta correlação com dados obtidos in vivo (WILLIAMS, 2000). A avaliação da digestibilidade de uma forrageira torna-se importante, baseando-se na necessidade de comparar diferentes materiais considerando-se que os mais digestíveis podem apresentar melhor retorno econômico e produtivo.
O método de digestibilidade de duplo estágio proposto por Tilley e Terry (1963) é um dos mais utilizados para avaliação da digestibilidade de forragens. Já em 1963, a técnica de
Tilley e Terry era capaz de estimar a digestibilidade in vitro da MS com boa precisão, no entanto com uma referência mínima à dinâmica da fermentação ruminal (MINSON, 1990). Com o intuito de permitir maior rapidez e a utilização rotineira da técnica na avaliação de forrageiras, Holden (1999) realizou adaptações para a utilização do simulador de rúmen que permite a avaliação simultânea de grande número de amostras. Segundo Holden (1999), Mabjeesh et al., (2000) e Wilman e Adesogan (2000) o simulador de rúmen Daisy II Ankom®, estimou com acurácia os valores de digestibilidade in vitro em comparação ao método tradicional e de referência proposto por Tilley e Terry (1963), mostrando, ainda, menos laboriosa e com menor demanda de tempo. Alguns estudos avaliaram a utilização de tecidos TNT para confecção de sacos para redução de custos, mas as estimativas foram superestimadas para digestibilidade aparente da matéria seca e da fração fibrosa em gramíneas e leguminosas tropicais (CICHOSKI et al, 2009).
Embora as técnicas discutidas anteriormente sejam eficientes na determinação da digestibilidade final do alimento, elas não fornecem informações sobre a cinética da fermentação, ou seja, as taxas com que esses alimentos são degradados pelos microrganismos ruminais. O conhecimento da cinética de fermentação dos alimentos é fundamental para permitir o balanceamento de dietas que visem o sincronismo de nutrientes no rúmen e estimar o potencial aproveitamento do alimento levando em consideração a taxa de passagem. O método inicialmente utilizado para obtenção desses dados foram ensaios in situ, mas como discutido para ensaios in vivo envolvem o uso de animais, o que limita o número de amostras e torna os estudos mais onerosos e trabalhosos. A técnica de mensuração da produção de gases para avaliação de alimentos foi introduzida como método de rotina após o trabalho de Menke et al. (1979), que mostrou a elevada correlação entre a produção de gases in vitro e a digestibilidade aparente in vivo. Blummel e Orskov (1993) adaptaram a técnica e passaram a fazer leituras periódicas de produção cumulativa de gases, iniciando os estudos sobre a cinética de fermentação dos alimentos pela produção de gases (RYMER et al., 2005). Diferentes metodologias são usadas para determinação da produção de gases dentre elas o teste das seringas de vidro graduadas (MENKE et al., 1979); a técnica do transdutor manual (THEODOROU et al., 1994); sistemas automáticos (PELL & SCHOFIELD, 1993), e semi–automáticos (MAURÍCIO et
al., 1999).
O sistema semi-automático proposto Maurício et al.(1999) estima o volume de gases por equação, a partir de leituras manuais de pressão. Essa equação é obtida para cada
laboratório mediante leituras simultâneas de pressão e volume de gases produzidos. O sistema apresenta menor custo comparado aos sistemas automáticos (PELL & SCHOFIELD, 1993), é de fácil manutenção e adaptabilidade e com redução considerável no tempo de mensuração comparado ao método proposto por Theodorou et al. (1994). Segundo Getachew et al. (1998) as avaliações de produção in vitro de gases podem ser utilizadas para predição do consumo voluntário de matéria seca (r=0,88) e matéria seca digestível (r=0,93) (BLUMMEL & ORSKOV, 1993; BLUMMEL et al., 1997; RODRIGUES et al., 2002). Contudo, deve-se associar a produção de gases à degradação dos substratos após 24 horas de incubação para o cálculo do fator de partição do substrato, permitindo uma estimativa da proporção de energia incorporado como massa microbiana, por meio de cálculos estequiométricos (ácidos orgânicos) (WILLIAMS, 2000; PASHAEI
et al., 2010). Alguns substratos apresentam diferenças na eficiência na síntese microbiana,
com altos volumes de gases, porém, apresentando comparativamente baixa produção de biomassa (RYMER et al., 1998; 1999).
Outro aspecto fundamental na técnica de produção de gases é o adequado ajuste dos dados ao modelo (FONDEVILLA & BARRIOS, 2001) para a obtenção dos parâmetros cinéticos que regem a fermentação, a fim de estimar adequadamente as degradabilidades efetivas e garantir a correta interpretação e associação dos resultados obtidos in vitro para processos que ocorre in vivo (FRANCE et al., 2000; LÓPEZ, 2005). Considerando constante a relação de produção de gases e degradação (Y=ΔG/ΔS; mL/g MS), a taxa fracional (μ) indica a proporção MS fermentada por hora (g/h). Vários modelos não-lineares, exponencial ou sigmoide, uni ou multi-compartimental, têm sido avaliados e a escolha depende do ajustamento as características de cada alimento, o que varia entre diferentes forrageiras, concentrados e subprodutos (LÓPEZ et al., 2011; SAHIN et al., 2011).
A princípio, as equações exponenciais propostas para experimentos in situ como as de Orskov e McDonald (1979) e McDonald (1981) foram empregadas na técnica in vitro de produção de gases pela simplicidade e popularidade do modelo e devido à similaridade entre as curvas de produção de gases e de degradabilidade. Continuamente vários outros modelos principalmente sigmoides foram avaliados (Anexo 1), buscando maior flexibilidade das curvas. O primeiro modelo sigmoide amplamente utilizado foi proposto por France et al. (1993), um modelo generalizado de Mitscherlich (unicompartimental), que assume uma taxa fracional de degradação variável ao longo do processo de degradação. As funções sigmoides são divididas em dois grupos: 1) com ponto de inflexão
fixo, como o modelo logístico clássico e o modelo de gompertz; e 2) ponto de inflexão flexível (variável) que pode ocorre em qualquer proporção da assíntota e/ou tempo de incubação, sendo capazes de representar curvas com ou sem ponto de inflexão, a exemplo dos modelos de France et al.(1993), Richards e Morgan (FRANCE et al., 2000). Noguera
et al. (2004) ressalta que o modelo de gompertz não apresenta um tempo de colonização,
mas determina um fator de eficiência microbiana que varia com o tempo à medida que a quantidade de substrato potencialmente fermentável diminui, reduzindo a taxa de fermentação ao longo do tempo de incubação.
Os estudos de digestibilidade in vitro e cinética de fermentação de forrageiras tropicais têm sugerido redução da fermentabilidade e degradabilidade da MS com o avanço do estádio fenológico da planta. Velásquez et al. (2009) avaliaram o capim-tifton 85, colhido a 15 cm do solo, nas idades de 28, 35 e 42 dias de rebrota, nos períodos de janeiro-março e abril- junho, pela técnica in vitro de produção de gases (MAURÍCIO et al., 1999). Esses autores utilizaram o modelo de France et al. (1993) e observaram que no período de janeiro-março houve semelhança entre as idades de corte para as produções de gases as 48 e 96 horas de incubação (216 e 250 mL/g MS). Já a idade de 28 dias, no período de abril-junho, apresentou menor produção de gases às 96 horas de incubação comparada as idades de 35 e 42 dias (221,8 vs. 240,9 mL/g MS), mas não houve diferença para as produções de gases as 48 horas de incubação (162,5 mL/g MS). As taxas de fermentação do capim-tifton 85 foram inferiores no período de abril-junho comparado ao período de janeiro-março para todas as idades avaliadas e houve variação entre as idades de corte. As degradabilidades efetivas (0,02/h) não foram influenciadas pela idade de rebrota, mas foram superiores para o período de janeiro-março comparado a abril-junho (0,453 vs. 0,415 g/kg MS).
Castro et al. (2010) avaliaram o capim-tanzânia entre 42 e 126 dias de rebrota e observaram reduções nas produções cumulativas de gases com o avanço da idade de corte, a partir de 24 horas de incubação. Os valores encontrados para 48 e 96 horas de incubação variaram de 186 a 128 mL/g e 232 a 173 mL/g, respectivamente, entre 42 e 126 dias. As taxas de fermentação também reduziram com o avanço da idade de corte, resultando em menores degradabilidades efetivas (0,02/h) nos estádios fenológicos mais avançados (0,465 a 0,338 g/kg MS entre 42 e 126 dias).
Já Castro et al. (2007) avaliando o capim-marandu, colhido aos 28, 56, 84 e 112 dias de rebrota, e Faria Jr et al. (2010) avaliando silagens de sorgo BRS-610, colhidos em oito estágio de maturação do grão (leitoso a seco), não observaram efeito do estágio de
maturação no potencial máximo de produção de gases, com valores médios de 235 mL/g MS e 170 mL/g MS, respectivamente. Contudo esses autores observaram reduções nas taxas de fermentação que refletiram em menores degradabilidades efetivas da fibra com o avanço da idade de corte. O processo fermentativo mais lento apresenta impacto negativo nas degradabilidades efetivas, resultando em perda de material potencialmente fermentável em razão da saída do rúmen com o aumento da taxa de passagem (SOUSA et al., 2011).