Técnicas Laboratoriais

Todas as pacientes tinham habitualmente colhido na maternidade 4 a 5 ml de sangue em tubo com gel separador, que era centrifugado, obtendo-se o soro para realização da triagem para sífilis no próprio serviço. Para as participantes do estudo, foi obtido deste mesmo tubo cerca de 2 ml de soro para realização dos testes da pesquisa.

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Todos os exames do padrão de referência e o DPP® Sífilis foram executados em soro, que foram descongelados em número suficiente para otimização da utilização dos kits. Os testes foram realizados manualmente, conforme instruções dos fabricantes, e lidos sem instrumental óptico (exceto o FTA-ABS, que é lido com microscópio de fluorescência). Exames do padrão de referência para sífilis da pesquisa:

SÍFILIS ELISA RECOMBINANTE v. 4.0 (Wiener Lab Group, Rosário, Argentina): possui antígenos recombinantes p15, p17 e p47 que detectam anticorpos específicos IgG produzidos contra o Treponema pallidum em diferentes estágios da doença. Possui sensibilidade de 100% e especificidade de 99,85%, segundo fabricante.

O kit possui policubetas recobertas com antígenos recombinantes, onde foram adicionadas as amostras de soro diluídas, incubando-se em estufa. Os anticorpos específicos da amostra se ligavam aos antígenos da cubeta. O material não ligado foi eliminado por lavagem, acrescentando-se o conjugado diluído contendo anticorpo monoclonal anti-IgG humana ligado a peroxidase e incubando-se novamente em estufa. Este conjugado ligava-se aos complexos antígeno-anticorpos formados previamente. O conjugado não ligado foi eliminado por lavagem. Acrescentava-se então uma solução com tetrametilbenzidina e peróxido de hidrogênio. As amostras reativas desenvolviam cor azul clara que ficava amarela quando se acrescentava o ácido sulfúrico. Foram consideradas negativas as amostras que não apresentaram coloração mais forte que os controles negativos. Toda amostra positiva foi repetida em duplicata, confirmando-se a positividade quando ambas fossem reativas.

TPHA (bioMérieux Brasil, Rio de Janeiro, Brasil): é composto por uma suspensão de eritrócitos estabilizados de aves, sensibilizados com componentes antigênicos do T. pallidum purificados, mostrando aglutinação quando reagem com anticorpos IgM e IgG contra esses antígenos. Possui 100% de sensibilidade e 99,7% de especificidade, segundo fabricante.

Cada amostra diluída foi colocada em uma cavidade de placa de microtitulação em fundo V, adicionando-se a suspensão de hemácias. Utilizou-se agitador de placas por 3 a 4 minutos e depois deixou-se a mesma em repouso por 1 hora. Então foi realizada a leitura. A presença de aglutinação indicava a existência de anticorpos. A ausência indicava inexistência de anticorpos ou existência destes abaixo do limite de detecção do teste. Reação negativa: quando as hemácias se depositavam no fundo da cavidade formando um botão. Reação positiva: quando as hemácias se depositavam no fundo da cavidade como um tapete, às vezes com bordas irregulares. Reação Intermediária: quando havia formação de um pequeno depósito no fundo da cavidade e o tapete de hemácias era pouco nítido. Este tipo de reação foi considerada positividade discreta.

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FTA-ABS (BioMérieux Brasil, Rio de Janeiro, Brasil): possui 100% de sensibilidade e especificidade, segundo fabricante. O treponema de Reiter do teste absorve ou bloqueia anticorpos não específicos produzidos contra treponemas saprófitas que possam estar presentes no soro, enquanto os anticorpos anti T. pallidum do soro ligam-se ao antígeno fixado na lâmina e são revelados pela antigamaglobulina marcada.

As amostras de soro diluídas com a solução absorvente e as lâminas permaneciam em temperatura ambiente por 15 minutos. As lâminas foram então colocadas em câmara úmida. Pingava-se 1 gota do controle positivo e negativo nas áreas 1 e 2 da lâmina respectivamente e das amostras diluídas nas áreas restantes. Incubavam-se as lâminas na câmara úmida por 30 minutos em temperatura ambiente e posteriormente lavava-se e secava-se as mesmas, retornando-as à câmara úmida por mais 30 min. Pingava-se 1 gota da antigamaglobulina marcada em cada área das lâminas, recobrindo-as totalmente. Repetia-se a lavagem e a secagem e pingava-se 3 a 4 gotas de glicerina tamponada entre as áreas reativas. Cobriam-se as lâminas com lamínula e secava-se o excesso de glicerina. Lia-se em microscópio de fluorescência. Reação negativa: ausência de fluorescência amarelo-esverdeada no espiroqueta. Geralmente não se observa o espiroqueta ou vê-se muito tenuamente. Reação positiva: presença de fluorescência amarelo-esverdeada no espiroqueta. Comparava-se sempre a reação com os controles positivo e negativo.

Teste a ser validado pela pesquisa:

DPP® Sífilis da Bio-Manguinhos (Rio de Janeiro, Brasil): é um teste rápido imunocromatográfico treponêmico que utiliza antígeno recombinante GST-p17 do T. pallidum ligado a uma membrana (fase sólida) e a um conjugado de proteína A com partículas de ouro coloidal (Ag + ptnA) (Figura 2). Possibilita detecção de anticorpos específicos com resultado em 20 minutos (FIOCRUZ, 2010; SUVISA, 2013; FIOCRUZ/BIOMANGUINHOS, 2013). Segundo dados não publicados encontrados no manual de treinamento TR DPP® HIV- 1/2 – Bio-Manguinhos / TR DPP® Sífilis (SUVISA, 2013), possui sensibilidade de 98,3% e especificidade de 98% em amostras clínicas, quando comparado ao TPPA. Os passos na realização do teste estão ilustrados na figura 4.

Teste realizado nas maternidades:

VDRL: realizado em soro pelas equipes de laboratório de cada maternidade com kit e técnica conforme rotina de cada serviço.

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Figura 4: Execução e interpretação do DPP® Sífilis Bio-Manguinhos:

A amostra é incorporada ao tampão de eluição (1, 2 e 3), com adição desta solução ao poço 1 (4). O tampão propicia o fluxo lateral promovendo a ligação dos anticorpos aos antígenos. Após a migração da solução (tampão de eluição + amostra) ao longo do suporte de teste, adiciona-se o tampão de corrida ao poço 2 (5). O conjugado se liga ao complexo antígeno-anticorpo na área TESTE (T) produzindo uma linha (roxa/rosa) neste local (6). Na ausência de anticorpo para sífilis, a linha (roxa/rosa) não aparece na área T (7). A eficiência do ensaio é controlada pela linha de controle (C) (6 e 7). Um reagente controle imobilizado na membrana do suporte determinará o surgimento desta linha, cuja presença demonstra que os reagentes estão funcionando corretamente e a ausência (8) que o teste não está funcionando adequadamente. 1 2 3 4 5 8 7 6

Adaptado de TR DPP® HIV- 1/2 – Bio-Manguinhos / TR DPP® Sífilis, Pedro Paulo Ribeiro (SUVISA, 2013) e do Manual de treinamento para TR DPP® Sífilis (FIOCRUZ/BIO-MANGUINHOS, 2013)

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