A preparação das amostras, também conhecido como tratamento da amostra, extração e concentração dos analitos, limpeza dos extratos (clean-up), permite que a análise dos componentes de interesse se torne possível, sendo considerada uma parte integrante e imprescindível no desenvolvimento do método para garantir a qualidade dos dados. A preparação da amostra tem como objetivo isolar o analito de interesse presente na matriz, eliminar ou minimizar a interferência de outros componentes da matriz e muitas vezes concentrar o analito que pode estar em baixas concentrações.
Nos últimos tempos, para melhorar a seletividade e sensibilidade, as inovações tecnológicas em ciência dos materiais e robótica e a compreensão aprofundada das matrizes abriram um caminho para muitas novas estratégias na preparação de amostras.
29 As técnicas mais utilizadas para extração dos microcontaminantes em matrizes ambientais são: a extração líquido-líquido (ELL) e a extração em fase sólida (EFS) ou Solid Phase Extraction (SPE). Devido ao uso de grandes voulmes de solvente nas ELL, a SPE é mais utilizada atualmente. Estas técnicas podem ser divididas em dois modos: off-line e on-line. No modo off-line, a etapa de extração e concentração do analito é realizada separadamente do sistema cromatográfico. Já no modo on-line, a etapa de extração e concentração do analito é realizada no próprio sistema cromatográfico.
Na extração líquido-líquido ocorre a partição da amostra entre duas fases imiscíveis (orgânica e aquosa). A eficiência da extração depende da afinidade do soluto pelo solvente de extração, da razão das fases e do número de extrações. Essa técnica possui muitas desvantagens, tais como: volumes relativamente grandes de amostras e de solventes são requeridos, gerando problemas de descartes; as amostras com alta afinidade pela água são parcialmente extraídas pelo solvente orgânico, resultando em perdas do analito; impurezas do solvente são concentradas junto com a amostra, implicando no uso de solventes ultrapuros; pode ocorrer formação de emulsões, o que dificulta o processo de extração e aumento no tempo.
Extração em Fase Sólida (SPE)
A extração em fase sólida tem sido uma das ferramentas mais empregadas para a extração e pré-concentração de analitos presentes em matrizes complexas. Esta técnica emprega sorventes recheados em cartuchos, nas formas de barril ou seringa, e os mecanismos de retenção são semelhantes àqueles envolvidos em cromatografia líquida em coluna. Um cartucho típico é formado por um tubo de polipropileno contendo cerca de 50 a 500 mg do material sorvente (suporte e fase), com 40-60 µm de tamanho de partícula, fixado no tubo através de dois filtros. Os procedimentos de SPE contêm geralmente 5 etapas: 1- ativação dos sítios ativos disponíveis no material sorvente; 2- condicionamento do sorvente com solvente adequado para ajustar as forças do solvente de eluição com o solvente da amostra; 3- introdução da amostra, para retenção do analito e às vezes de alguns interferentes; 4) limpeza do cartucho (clean-up) para retirar os interferentes; 5) eluição do(s) analito(s).
Uma grande variedade de sorventes está disponível comercialmente e podem ser combinados com o objetivo de aumentar a seletividade da extração. Uma maneira de combinação é usando as chamadas fases mistas com vários grupos funcionais de
30 características diferentes ligados ao mesmo suporte. Pode-se também realizar sucessivas extrações com cartuchos de diferentes recheios, passando o material eluido do primeiro cartucho para o segundo no modo on-line ou off-line (Queiroz, 2001). Dos sorventes disponíveis, os mais frequentemente utilizados na extração e concentração de fármacos e perturbadores endócrinos são os de C18, que consiste em cadeia alifática de 18 carbonos em suporte de sílica, e HLB Oasis® que consiste em um copolímero poroso, o poli(divinil–benzeno–co-N-vinilpirrolidona), com uma capacidade de adsorção de compostos hidrofílicos e lipofílicos simultaneamente.
Devido às diferentes propriedades físico-químicas (ácidos / bases / anfóteros, e os valores de pKa único ou múltiplos) dos analitos de interesse, esses cartuchos tradicionais nem sempre foram adequados e a disponibilidade de diferentes fases estacionárias foi necessária (Kole, 2010). Atualmente com o desenvolvimento da ciência dos materiais, estão disponíveis várias fases estacionárias para SPE.
Embora SPE convencional ofereça várias vantagens, ela tem suas próprias limitações, como a seletividade limitada e / ou baixa recuperação. Além disso, muitos componentes da matriz podem ser adsorvidos contribuindo para o efeito matriz em análises que utiliza o LC/MS/MS (Rodriguez-Mozaz et al., 2007).
Microextração em Fase Sólida (SPME)
A microextração em fase sólida é uma técnica que emprega uma fibra de sílica fundida, recoberta com um filme fino de um polímero (polidimetilsiloxano, poliacrilato carbowax, etc.) ou de um adsorvente sólido (carvão ativo microparticulado ou carboxen). Esta fibra revestida, que é uma fase extratora, é acondicionada dentro da agulha de uma microseringa, para a extração dos analitos (Valente, 2000). A extração pode ser feita das seguintes maneiras: mergulhando a fibra diretamente na solução da amostra onde os analitos são concentrados de 2 a 15 min, ou através da técnica de headspace, na qual a amostra é aquecida e os componentes voláteis são adsorvidos na fibra na fração gasosa. Após a extração, os analitos presentes na fibra são dessorvidos termicamente pela sua introdução no injetor aquecido de um cromatógrafo a gás.
As vantagens do método de SPME são que o procedimento analítico é mais simples e mais rápido que SLL e SPE, e em geral extratos mais limpos são obtidos. Por outro lado o analito necessita ser volátil e termicamente estável para ser dessorvido e determinado por cromatografia gasosa - CG (Queiroz et al, 2001).
31 Apesar de pouco usual, SPME pode ser utilizado em cromatografia de fase líquida, pela adaptação do injetor para a lavagem da fibra pela fase móvel e eluição dos analitos.
Polímeros com Impressão Molecular (MIPs)
Os polímeros com impressão molecular (MIPs) são polímeros que possuem sítios de reconhecimento que são intencionalmente projetados e específicos para uma substância alvo ou classe de analitos, fornecendo assim alta seletividade e especificidade (Widstrand et al., 2006). Apesar de incipiente, essa técnica é considerada uma das mais seletivas entre todas as disponíveis na SPE para preparação de amostra (Masque et al., 2001).