Período (h) 21 23,9 ± 0,1 23,5 ± 0,3 21 23,5 ± 0,3 23,5 ±0,2 Variância (%) 8,7 ± 1,4 15,8 ± 4,0 26,3 ± 0,1 10,8 ± 3,9 12,5 ± 5,3 28,8 ± 10,4
T21C - primeiro T21; CCC - claro constante iniciado após um dia de coincidência; T21N - segundo T21; CCN - claro constante iniciado após um dia de não-coincidência.
41 Figura 10: Potência espectral, indicada pela porcentagem da variância da atividade motora explicada pelos CSL e CNSL. Cada ponto representa o valor médio com o desvio padrão para os animais durante cada ciclo T no Experimento 1. (%VSP – variance of significant period; T24b – porcentagem da variância dos 14 dias anteriores (before) ao T21; T24a – valores correspondentes aos 14 dias seguintes (after) ao T22).
0 10 20 30 40 50 60 T24b T21 T21.5 T22 T24a % VS P Ciclos CE CSL CNSL
42 Figura 11: Actograma da frequência das vocalizações de todas as saguis sob ciclos CE simétricos com períodos de 21, 21,5, 22 e 24h, correspondentes ao Experimento 1. As colunas brancas representam a fase de claro e as cinzas representam a fase de escuro. As ausências de dados durante o T22 ocorreram devido a problemas no registro. Os dados estão totalizados em intervalos de 15 min.
Figura 12: Actogramas e periodogramas (Sokolove-Bushell) da frequência das vocalizações de todas as saguis em conjunto sob T21 (esq.), T21.5 (meio) e T22 (dir.) durante o Experimento 1. As ausências de dados no actograma do T22 entre os dias 16 e 18, 34 e 40, 46 e 49, ocorreram devido a problemas no registro. Os actogramas estão nos módulos dos respectivos Ts. Os dados estão totalizados em intervalos de 15 min. (1240 min = 20.7 h; 1415 min = 23.6 h; 1290 = 21.5 h; 1335 min = 22.2 h; 1320 min = 22 h; 1390 min = 23.2 h).
Sem registro
Sem registro Sem registro
43 Figura 13: Actogramas em módulo de 24 h para 2 machos (esq.) e 2 fêmeas (dir.) durante o Experimento 2. O CC iniciado no dia 42 ocorreu em seguida a um dia de coincidência para Obama, Bastos e Fleury e após um dia metade não coincidente e metade coincidente para Fatinha, enquanto o CC iniciado no dia 84 ocorreu após um dia de não coincidência para todos. A partir do dia 89 Obama reduziu muito a atividade motora por estar enfermo. O aparente segundo componente na atividade de Fatinha foi devido ao sensor de sua gaiola captar temporariamente um pouco da atividade de Bastos, cuja gaiola era vizinha a sua. As colunas brancas representam a fase de claro e as cinzas representam a fase de escuro. Os dados estão totalizados em intervalos de 5 min
44 Figura 14: Actogramas em módulo de 24 h para 2 machos (esq.) e 2 fêmeas (dir.) durante o Experimento 2. O CC iniciado no dia 42 ocorreu em seguida a um dia de coincidência para Fizi, Safira e Flora e após um dia metade não coincidente e metade coincidente para Orestes, enquanto o CC iniciado no dia 84 ocorreu após um dia de não coincidência para Safira e após um dia metade não coincidente e metade coincidente para Fizi, Orestes e Flora. O aparente segundo componente na atividade de Flora foi devido ao sensor de sua gaiola captar temporariamente um pouco da atividade de Orestes, cuja gaiola era vizinha a sua. As colunas brancas representam a fase de claro e as cinzas representam a fase de escuro. Os dados estão totalizados em intervalos de 5 min.
45 Figura 15: Actogramas em módulo de 21 h da atividade motora dos saguis durante o Experimento 2. Para comparação visual dos pós-efeitos na atividade motora dos saguis em T21 devido a diferentes condições prévias, os actogramas das colunas 1 e 3 correspondem ao T21 em seguida ao T24, enquanto os actogramas das colunas 2 e 4 correspondem ao T21 em seguida ao claro constante. Por estar enfermo, Obama apresentou uma redução brusca na atividade motora durante o segundo claro constante. O aparente segundo componente na atividade de Fatinha foi devido ao sensor de sua gaiola captar temporariamente um pouco da atividade de Bastos, cuja gaiola era vizinha a sua. As colunas brancas representam a fase de claro e as cinzas representam a fase de escuro. Os dados estão totalizados em intervalos de 5 min.
46 Figura 16: Actogramas em módulo de 21 h da atividade motora dos saguis durante o Experimento 2. Para comparação visual dos pós-efeitos na atividade motora dos saguis em T21 devido a diferentes condições prévias, os actogramas das colunas 1 e 3 correspondem ao T21 em seguida ao T24, enquanto os actogramas das colunas 2 e 4 correspondem ao T21 em seguida ao claro constante. O aparente segundo componente na atividade de Flora foi devido ao sensor de sua gaiola captar temporariamente um pouco da atividade de Orestes, cuja gaiola era vizinha a sua. As colunas brancas representam a fase de claro e as cinzas representam a fase de escuro. Os dados estão totalizados em intervalos de 5 min.
Figura 17: Actogramas e Periodogramas (Sokolove-Bushell) da atividade motora de saguis machos (esq.) e fêmeas (dir.) durante o T21 seguido de CC após um dia de coincidência em T21 no Experimento 2. Os actogramas estão em módulo de 21h. Os periodogramas ao lado de cada actograma são referentes ao T21 (acima) e ao CC (abaixo). As colunas brancas representam a fase de claro e as cinzas representam a fase de escuro.
48 Figura 19: Fase de início do ritmo de atividade motora em livre-curso sob CC após um dia de coincidência em T21 (esq.) e após um dia de não coincidência em T21 (dir.). Cada ponto representa a fase de um animal. (Teste de Rayleigh).
Figura 18: Actogramas e Periodogramas (Sokolove-Bushell) da atividade motora de saguis, sendo 3 fêmeas e 1 macho (abaixo à esq.) durante o T21 seguido de CC após um dia de não-coincidência em T21 no Experimento 2. Os actogramas estão em módulo de 21h. Os periodogramas ao lado de cada actograma são referentes ao T21 (acima) e ao CC (abaixo). As colunas brancas representam a fase de claro e as cinzas representam a fase de escuro.
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Discussão
Estudos anteriores relatam que ciclos CE simétricos diferentes de 24 h e próximos aos limites de sincronização são capazes de induzir a expressão de um padrão rítmico com dois componentes circadianos simultâneos em roedores (Cambras et al. 2007; Campuzano et al. 1998; Neto et al. 2008; Schwartz et al. 2009; Vivanco et al. 2010). Os saguis do presente estudo também apresentaram dois ritmos circadianos nos ritmos de atividade motora e de vocalizações quando estavam sob ciclos CE com periodicidades de 21, 21.5 e 22 h. Assim como descrito nos estudos anteriores (Cambras et al. 2007; Campuzano et al. 1998; Neto et al. 2008; Schwartz et al. 2009; Vivanco et al. 2010), um componente apresentava o mesmo período do ciclo CE, sendo então denominado componente sincronizado pela luz (CSL), enquanto o outro estava em livre-curso, sendo então denominado componente não-sincronizado pela luz (CNSL).
Uma possível explicação para o surgimento desses dois componentes é que os saguis não sincronizaram a esses Ts, expressando a atividade motora em livre-curso, refletida pelo CNSL, mas sob forte mascaramento pelo escuro que inibe a atividade motora, provocando a expressão do componente com o mesmo período do ciclo CE. Uma evidência de mascaramento é o alongamento brusco do alpha no primeiro dia em CC após um dia de não coincidência. Outra evidência é que havia uma redução brusca tanto na atividade motora quanto nas vocalizações quando o dia biológico coincidia com a fase de escuro do ciclo CE, o que pode ter levado a um aumento na potência espectral do CSL, assim como à diminuição da potência espectral do CNSL. Além disso, os animais exibiram picos reativos nas transições de CE, sendo um logo após o acender das luzes e outro logo após o início do escuro, ou seja, ocorreram em resposta a uma mudança ambiental, sendo essa uma característica típica de mascaramento.
Contudo, várias outras evidências indicam que adicionalmente ao processo de mascaramento também houve alterações dos parâmetros rítmicos por processos de arrastamento, tais como: 1) os transientes observados na atividade motora nas transições entre os ciclos CE menores que 24 h; 2) a expressão da atividade e das vocalizações num padrão recorrente de sucessivos avanços seguidos de um grande atraso de fase, típico de processo de coordenação relativa, pelo qual o zeitgeber é
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capaz de alterar os parâmetros do marcapasso circadiano, mas não é forte o bastante para promover uma sincronização estável; 3) o alongamento gradual do alpha na ressincronização ao T24 após os ciclos CE menores que 24 h; 4) o período do CNSL da maioria dos animais ser diferente do expresso sob CC; 5) pelo teste de Rayleigh ter sido encontrado um agrupamento significativo do início da fase de atividade para a maioria dos saguis em CC, tanto após um dia de coincidência quanto um dia de não coincidência no T21; 6) a atividade motora de Orestes que sob CC continuou avançando por alguns dias a partir da relação de fase que mantinha com o ciclo CE anterior de 21 h. Como o sagui sob condições ambientais constantes apresenta naturalmente uma tendência para encurtar o período endógeno, devido ao seu período endógeno ser em torno de 23,3 ± 0,4 h (Erkert 1989; Glass et al. 2001; Silva et al. 2005), então fica difícil separar se o encurtamento do período endógeno sob CC foi devido à expressão de sua ritmicidade endógena ou se foi efeito do CE anterior. Contudo, a atividade motora de Orestes é particularmente interessante por ele apresentar um período endógeno muito próximo, às vezes até maior que 24 h, e ter continuado avançando sob CC. Seu período endógeno estava menor que 24h e foi aumentando gradualmente até ficar bem próximo ou maior que 24h, sendo esta uma clara evidência de alterações rítmicas por influência do T21.
Com base nas evidências expostas acima, propomos que os dois componentes circadianos simultâneos surgem nos ritmos de atividade motora e vocalizações dos saguis devido a uma sincronização parcial do sistema circadiano, estando pelo menos um grupo de osciladores sincronizado ao ciclo CE pelos processos de mascaramento e coordenação relativa, resultando no CSL, enquanto pelo menos outro grupo de osciladores continua expressando a ritmicidade endógena, embora também sob influência de mascaramento pelo ciclo CE.
Essa ideia está em concordância com o proposto pelos autores dos trabalhos anteriores com roedores, segundo os quais a principal explicação para a ocorrência desses dois componentes é que eles sejam o reflexo de um sistema multioscilatório, em que pelo menos um grupo de osciladores está sincronizado ao ciclo CE, enquanto pelo menos outro grupo de osciladores está em livre-curso, ou seja, que os dois componentes ocorrem devido a uma sincronização parcial do sistema circadiano
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(Cambras et al. 2007; Campuzano et al. 1998; de la Iglesia et al. 2004; Vivanco et al. 2010). Os resultados que mais fortalecem essa hipótese são os do trabalho de de la Iglesia e colaboradores (2004), que mostraram uma dissociação morfofuncional no NSQ. Eles demonstraram que a expressão gênica no NSQ de ratos sob T22 refletia a expressão dos dois componentes, ou atividades separadas de dois grupos de osciladores, sendo um na subdivisão dorsomedial, responsável pela geração do CNSL, e outro na subdivisão ventrolateral, responsável pela geração do CSL.
Contudo, a partir dos resultados desse trabalho, propomos que o mascaramento atua sobre a expressão dos dois componentes, CSL e CNSL, diferentemente dos outros autores que propõem que o mascaramento atua somente sobre a expressão do CSL, sendo a expressão do CNSL relacionada apenas com a ritmicidade endógena do marcapasso (Campuzano et al. 1998; Vivanco et al. 2010). Alguns autores até denominam o CNSL como não dependente da luz (Vivanco et al. 2010). Para nós, os trabalhos com roedores não mostram a evidência do mascaramento no CNSL pelo fato dos sujeitos experimentais serem polifásicos, apresentando vários episódios de atividade na fase de claro apesar de serem noturnos. Por exemplo, os ratos são predominantemente noturnos, mas também apresentam atividade durante a fase de claro, mesmo quando estão sob T24. O degus apesar de ser considerado diurno, apresenta grande variação de cronotipo em laboratório, podendo inclusive alternar entre diurnalidade e noturnalidade dependendo apenas da disponibilidade de roda de atividade na gaiola (Otalora et al. 2010; Vivanco et al. 2010). Ou seja, para essas espécies o claro não é tão aversivo quanto o escuro é para os saguis, espécie estritamente diurna em habitat natural ou em laboratório sob T24 (Erkert 1989; Menezes et al.1993; Moreira et al. 1991). Dessa forma, a expressão do CSL e do CNSL deve ter sido fortemente influenciada pelo mascaramento negativo do escuro inibindo a expressão tanto da atividade quanto das vocalizações, principalmente quando havia coincidência entre o dia biológico do animal com a noite do ciclo CE.
Analisando a influência dos ciclos CE menores que 24 h sobre a expressão do CSL e do CNSL, observou-se nos ritmos de atividade motora que ambos os componentes foram exibidos por todos os saguis sempre que submetidos ao T21 mas, conforme a duração do ciclo CE ia aumentando e se aproximando de 24 h, diminuía o número de
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animais exibindo os dois componentes, passando a exibir apenas o CSL. Isso ocorreu para uma sagui sob T21.5 e quatro sob T22, que passaram a exibir a atividade motora ou em um padrão típico de coordenação relativa ou de sincronização por arrastamento, mas com uma relação de fase diferente da apresentada quando estão sob T24. Esse dado é interessante porque difere de um estudo anterior com saguis sob ciclos CE diferentes de 24 h, segundo o qual nenhum sagui sincronizou ao T22, apresentando sincronização estável apenas quando submetidos a T23 (Harter & Erkert 1993). Uma possível explicação para essa diferença é que os pós-efeitos devido à exposição aos
T21 e T21.5 anteriormente ao T22 tenham facilitado a sincronização estável ao T22.
Outra possível explicação é que essa diferença seja devido à variação interindividual dos períodos endógenos, o que possibilita que animais com períodos endógenos mais curtos sincronizem a ciclos CE tão curtos como os de 21.5 e de 22 h. De fato, essas fêmeas geralmente apresentavam o período do CNSL mais curto do que as outras presentes no mesmo experimento. Essa variação interindividual na periodicidade endógena pode ser devido à variação geográfica, ou seja, devido a diferenças nas frequências alélicas das bases genéticas de populações distanciadas geograficamente (Futuyma 1992). Dois fatos interessantes reforçam essa ideia: 1) dos animais submetidos aos ciclos CE menores que 24 h, Safira era a única de origem selvagem, enquanto todas as outras nasceram na mesma colônia. Ela foi a única sagui que apresentou a potência espectral do CSL maior que a do CNSL durante o T21 e que já passou a exibir a atividade motora com apenas um componente circadiano quando estava sob T21.5. Somado a isso, o período do seu CNSL era bem menor que o das outras fêmeas; 2) o estudo de Harter & Erkert (1993) foi realizado com animais de uma colônia na Alemanha, os quais podemos presumir que há pelo menos 15 anos não tiveram contato algum com saguis do Nordeste do Brasil, se é que algum dia tiveram, e muito menos com animais da colônia do Núcleo de Primatologia da UFRN, de onde vieram nossos animais. Ou seja, a base genética dessas populações pode ser diferente o bastante, de modo que os animais utilizados no estudo na Alemanha tenham períodos endógenos um pouco maiores que os animais daqui, no Nordeste do Brasil.
Outra influência dos ciclos CE menores que 24 h, sobre a expressão do CSL e do CNSL, foi a potência espectral do CSL aumentando em conformidade com o aumento
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do T, semelhante ao descrito para a atividade motora de ratos (Campuzano et al. 1998). Contudo, para os ratos observou-se uma complementaridade da potência espectral dos dois componentes visto que, conforme a potência espectral do CSL aumentava com o aumento do T, diminuía a potência espectral do CNSL. No presente estudo, os saguis não apresentaram complementaridade da potência espectral dos dois componentes, pois apesar de se observar uma tendência à diminuição do CNSL, a mesma não foi estatisticamente significativa. Além disso, observou-se a ocorrência de atividade e vocalizações na fase de escuro sob os ciclos CE menores que 24 h, de modo que quanto mais curto era o T maior era a ocorrência dessas variáveis na fase de escuro. Esse dado é particularmente interessante, pois a ocorrência de vocalizações e atividade na fase de escuro indica que os animais estavam ativos e alerta apesar da condição ambiental ser propícia ao repouso para essa espécie estritamente diurna (Erkert 1989; Menezes et al.1993; Moreira et al. 1991). Isso é semelhante ao que ocorre com trabalhadores em turnos ou noturnos, que por imposição dos horários de trabalho se expõem a diferentes fotoperíodos em curtos intervalos de tempo, o que leva à dessincronização entre os osciladores endógenos (Waterhouse, Reilly, Atkinson, Edwards 2007). Essa dessincronização interna provoca distúrbios na ritmicidade circadiana, de modo que esses trabalhadores podem estar bem alerta na fase de escuro, condição ambiental propícia ao repouso, ou estar sonolentos na fase de claro, condição ambiental propícia à atividade para os humanos. Ainda mais importante que isso, esses distúrbios na ritmicidade circadiana podem dificultar a recuperação e gerar muitas doenças, sendo inclusive considerada como fator provavelmente carcinogênico pela Agência Internacional de Pesquisa em Câncer (Filipski & Levi 2009). Essa proposta é reforçada por estudos que observaram aceleração no crescimento de tumores, devido a distúrbios na ritmicidade circadiana promovidos por modificações nos sincronizadores alimentares, administração de agentes farmacológicos (Filipski & Levi 2009), destruição do NSQ ou por um modelo crônico de jet lag (Filipski et al. 2006; Filipski & Levi 2009).
Um modelo proposto como promotor de dessincronização interna em ratos é o ciclo CE simétrico de 22 h. Vários autores sugerem que esse protocolo de dessincronização forçada seja um excelente modelo para se estudar os mecanismos de
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sincronização, pois propicia um aprofundamento no conhecimento do mecanismo de acoplamento entre as células do NSQ e no entendimento da plasticidade na vida real, podendo levar ao desenvolvimento de novos tratamentos para todos esses distúrbios da ritmicidade circadiana (Campuzano et al. 1998, Neto et al. 2008). Schwartz e colaboradores (2009) sugerem que a dessincronização forçada das subdivisões ventrolateral e dorsomedial do NSQ promovida por esse modelo oferece uma oportunidade de acessar a habilidade dessas duas subdivisões de sustentar saídas circadianas independentes, de forma não invasiva, como ressaltado por Schwartz (2009).
Embora nossos dados sejam apenas comportamentais, os ritmos de atividade motora e vocalizações são saídas rítmicas que representam o funcionamento do sistema circadiano, podendo ser então considerados como evidências para nossa hipótese de que o sistema circadiano de primatas é semelhante ao de roedores, sendo composto por pelo menos dois grupos de osciladores que atuam acoplados entre si, e que esse acoplamento pode ser quebrado pela exposição desses animais a ciclos CE próximos ao limite de sincronização. Dessa forma, sugerimos que o T21 promove dessincronização interna nos ritmos circadianos dos saguis, da mesma forma que o
T22 promove nos ritmos circadianos dos ratos (Cambras et al. 2007; Campuzano et al. 1998; Neto et al. 2008; Schwartz et al. 2009) ou que o T21 e o T28 promovem nos ritmos circadianos do degus (Vivanco et al. 2010). O T21 foi assim considerado por ter sido o único capaz de promover dissociação dos ritmos circadianos em todos os saguis, sempre que os mesmos foram submetidos a ele, e exibindo ambos os componentes com potências espectrais bem próximas.
Em relação à diferença de gênero na dissociação, a única diferença observada no presente estudo foi que no segundo T21, que ocorreu após um dia de não coincidência para a maioria dos animais, os machos exibiram o CNSL com maior potência espectral do que o CNSL das fêmeas. No estudo de Campuzano et al. (1998), ratos dissociados também apresentaram diferenças entre machos e fêmeas, sendo que nesse caso foram as fêmeas que expressaram tanto o CSL quanto o CNSL da atividade motora com maior potência espectral do que os machos. Os autores sugerem que diferenças na
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estrutura do sistema circadiano dos ratos sejam as responsáveis por essas diferenças entre machos e fêmeas.
Em estudo com macacos da espécie Macaca mulatta, também conhecidos como macacos rhesus, foi observado para as variáveis fisiológicas de temperatura corporal, batimentos cardíacos, atividade física e alimentação que os ritmos circadianos das fêmeas eram atrasados em comparação aos ritmos dos machos, embora não houvessem diferenças na média ou amplitude entre os gêneros (Barger et al. 2010). Todos esses resultados fortalecem a hipótese proposta por Barger et al. (2010) de que o sistema circadiano deve apresentar diferenças fundamentais entre machos e fêmeas. Além disso, propomos que essas diferenças variam dependendo da espécie, pois enquanto nos saguis, que são primatas diurnos, foram os machos que apresentaram o CNSL com maior potência espectral, nos ratos, que são roedores noturnos, foram as fêmeas que apresentaram. Dessa forma, sugerimos que os estudos cronobiológicos envolvam, sempre que possível, animais de ambos os gêneros para que essas diferenças sejam mais investigadas.
Como o ciclo CE de 21 h foi o único que promoveu o surgimento dos dois componentes circadianos simultâneos nos ritmos circadianos de todos os animais, esse foi então considerado o período promotor de dissociação na ritmicidade circadiana de saguis. Devido às diferentes características desses componentes, sugerimos que essa dissociação é resultado de sincronização parcial ao T21, onde pelo menos um grupo de osciladores está sincronizado ao ciclo CE por processos de coordenação relativa e mascaramento, enquanto pelo menos outro grupo de osciladores está em livre-curso,