Taxonomia e identificação de Phytophthora spp

Em geral, a identificação de micro-organismo é feita através da taxonomia clássica, baseando-se nas suas características morfofisiológicas.

Em algumas situações têm existido dificuldades para a classificação de algumas espécies, como é o caso daquelas que apresentam reprodução

assexuada, ou quando apresentam pleomorfismo. Além disso, alguns aspectos morfológicos dificultam a identificação da espécie, de modo que a identificação clássica se torna pouco adequada. Apesar de que, atualmente, os critérios utilizados na taxonomia clássica de micro-organismos receberem críticas, esses ainda são utilizados na maioria dos estudos fitopatológicos. Estudos de caracterização morfofisiológica de micro-organismos são ainda importantes para estudos de distribuição espacial, para identificação de gênero, de espécies, de aspectos biológicos e ecológicos, dentre outros.

De acordo com Shurtleff e Averre III (1997), a identificação dos agentes causais de doenças de plantas envolve princípios científicos e tecnológicos, incluindo a biologia molecular, que devem estar associados aos conhecimentos sobre os hospedeiros e às práticas agrícolas empregadas.

Luz e Matsuoka (1996) estudando a taxonomia do gênero Phytophthora, apontaram que o maior problema para identificação de espécies são aqueles referentes às variações morfológicas das estruturas reprodutivas e vegetativas nas diferentes condições de cultivo ou de ambiente e às técnicas utilizadas para indução de formação de determinadas estruturas. Waterhouse (1963) elaborou uma chave taxonômica para classificar espécies de Phytophthora baseada em critérios morfológicos e fisiológicos, tais como a presença e tamanho de esporângios, de clamidósporos e de oósporos, natureza dos anterídios e a presença ou não de papilas nos esporângios.

Segundo Luz e Matsuoka (1996), a partir de então seus trabalhos têm contribuído enormemente para que taxonomistas e fitopatologistas possam classificar e identificar espécies desse gênero.

A diagnose convencional de doenças tem levado em consideração, principalmente, a sintomatologia da doença. A grande dificuldade em usar sintomas para diagnosticar doenças de plantas reside no fato de que diferentes doenças podem apresentar quadro de sintomas semelhantes (DUARTE BOA, 2005). Métodos mais sofisticados, com maior sensibilidade, como PCR (Polimerase Chain Reation), associados à sintomatologia tornam a diagnose mais completa e confiável.

Devido às vantagens, esta técnica tem sido exaustivamente empregada no diagnóstico e caracterização de vírus e viróides (HUANG et al., 2004; UGA

et al., 2005; DU et al., 2006), bactérias (NUNES et al., 2004; CUBERO, GRAHAM, 2005) e fungos fitopatogênicos (MATSUDA et al., 2005).

O desenvolvimento de métodos moleculares permitiu o estudo das relações filogenéticas tanto dentro do gênero Phytophthora quanto deste com outros organismos. Várias técnicas como padrões de proteínas totais, isoenzimas, RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), SSPC (Single-Strand-Comformation Polymorfism), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), SSR (Simple Sequence Repeats) e análises de sequências da região ITS do DNA ribossômico (rDNA) e de outros genes nucleares e mitocondriais têm sido úteis para determinar diferenças genéticas ou semelhanças entre as espécies. Estas técnicas, mas principalmente a análise de sequência de DNA, combinadas com dados morfológicos, subsidiaram a solução de diversos problemas na sistemática do gênero (SOUZA et al, 2007).

A região ITS (internal transcribed spacer) é a mais sequenciada em oomicetos do gênero Phytophthora devido ao elevado nível de variações, maior que das regiões SSU (“Small Subunit”) e LSU (“Large Subunit”) do rDNA. O grau de variabilidade nas sequências de rDNA pode ser usado na classificação específica e subespecífica (PALLOIX et al., 1988; LEE e TAYLOR, 1992; LEE et al., 1993; FOSTER et al., 2000; ZHANG et al., 2004).

Segundo Martim e Tooley (2003), o avanço do emprego de técnicas moleculares nos últimos anos, na taxonomia do gênero Phytophthora, apresentou novos procedimentos e informações sobre a caracterização e identificação de espécies ou grupos nesse gênero, bem como o estudo das relações filogenéticas.

Para Fedorka et al. (2001), a análise SSCP é uma busca rápida e sensitiva para caracterizar sequências de DNA. Além disso, o autor afirma que, desde sua descrição, ele tem sido usado com êxito para detectar várias alterações nas sequências de base do DNA incluindo substituições, deleções, inserções e redistribuição. Produtos de PCR são agora rotineiramente usados para análises SSCP (PCR-SSCP). A técnica do SSCP foi inicialmente desenvolvida para examinar pontos de mutações no DNA humano. Mutação em DNA de fita simples tem sido estudada por esta técnica, desenvolvida por Orita et al. (1989).

O método tem sido ampliado para detecção de mutações em micro-organismos que resultam em resistência antimicrobiana, podendo também ser utilizado como marcador molecular em estudos epidemiológicos de bactérias, fungos e vírus (KERR e CURRAM (1996); SEKIYA, (1993); SLAUBAUGH et al.

(1997). Os autores também afirmaram que o método SSCP foi considerado um método rápido, sensitivo e barato para detectar variações de sequências.

Desde então, tem sido estendido para estudar variabilidade de patógenos de plantas, incluíndo viroses (KONG et al, 2000), nematóides (CLAPP et al., 2000) e fungos (MORICCA et al., 2000).

Assim, segundo Sousa et al. (2001) a técnica baseia-se no fato de que o DNA dupla fita, quando desnaturado, migra como dois fragmentos de DNA fita simples em eletroforese com gel de poliacrilamida não desnaturante. Essa migração das duas fitas depende da sequência de nucleotídeos e da conformação adquirida nas condições de eletroforese. Por isso, procede-se a desnaturação das amostras de DNA para se obter a cadeia simples.

Fragmentos do mesmo comprimento (número de bases) podem assumir diferentes conformações devido as mutações pontuais em suas sequências.

Baseia-se no fato de que as diferenças em um único nucleotídeo são suficientes para que a cadeia simples de DNA adquira uma conformação diferente. A grande vantagem dessa ferramenta é a possibilidade de uma rápida varredura em busca dos polimorfismos na região estudada em questão e os baixos custos e a simplicidade dos equipamentos necessários para sua geração.