Tecnologia de phage display

A tecnologia de phage display, proposta por Smith (1985), apresentou um grande impacto na imunologia e biologia celular, possibilitando a descoberta de novos fármacos, vacinas e melhoria dos testes diagnósticos em geral, sendo uma ferramenta útil por permitir a identificação e caracterização de peptídeos ligantes frente a uma variedade de moléculas, como as imunoglobulinas; envolvidas diretamente na resposta

25 imune aos agentes infecciosos (Blank et al, 1999). A técnica pode ser utilizada para revelar os diversos tipos de interações que existem na relação antígeno-anticorpo, definir epítopos para anticorpos monoclonais, selecionar substratos para enzimas, dentre outras aplicações (Kay et al, 1996).

Essa tecnologia utilizadifenretes classes de bacteriófagos (ou fagos), filamentodos ou não. No caso deste trabalho, fagos filamentosos da classe M13, capazes de infectar bactérias gram-negativas, como Escherichia coli, foram utilizados. A partícula de fago é formada por uma fita de DNA simples, envolta por uma capa proteica constituída por cinco proteínas: pIII, pVI, pVII, pVIII e pIX, conforme ilustrado na figura 2 (Housmand et al, 1999).

Figura 8- Representação da estrutura de um fago filamentoso. A) Composição do gene III mostrando o sítio de ligação de clonagem para introdução do gene adicional. B) Partícula viral com as proteínas pIII, pVI, pVII, pVIII e pXI. C) Cristalografia dos domínios D1 e D2 da proteína III (Holliger & Williams, 1999).

A técnica utiliza o princípio de que polipeptídeos podem ser expressos na superfície de bacteriófagos pela inserção de um segmento de DNA codificante no genoma dos mesmos, de modo que o peptídeo ou a proteína expressa fique exposta na superfície da partícula viral, fusionada a uma proteína endógena do vírus, como é o caso das proteínas pIII e pVIII (Barbas et al, 2001; Benhar, 2001).

A exposição de um peptídeo aleatório na superfície do fago possibilita a sua atuação como um ligante a uma enzima, um imunógeno ou desempenhando qualquer outra atividade em processos biológicos. A inserção de oligonucleotídeos e a subsequente construção de bibliotecas de peptídeos tornam possível a seleção de

26 proteínas com afinidades específicas (Makowski, 1994). Esta ligação entre o genótipo e fenótipo permite o enriquecimento de fagos selecionados, por exemplo, usando processos de bio-seleção (ou bio-pannings) frente a um determinado alvo. Dessa forma, fagos que exibem um ligante que seja relevante são retidos em virtude de sua ligação com o alvo, enquanto que os fagos não-aderentes são retirados por processo por meio de sucessivas lavagens (Benhar, 2001). Tal processo de seleção é realizado artificialmente, no qual a molécula alvo é imobilizada em um suporte sólido, geralmente, uma placa de ELISA de fundo chato, entretanto, beads, resinas ou membranas podem também podem ser utilizados.

O fato do fago M13 ter a capacidade de infectar bactérias E. coli, pela ligação da proteína pIII ao pillus F da célula bacteriana (Azzazy & Highsmith, 2002), permite a amplificação do número desses clones selecionados utilizando a maquinaria celular das bactérias (Barbas et al, 2001). As partículas de fago são processadas no espaço periplasmático da bactéria (Benhar, 2001), sendo que o gene lacZ no bacteriófago permite a distinção entre as colônias bacterianas infectadas com os fagos que carregam sequências exógenas, representadas pela coloração azul, daquelas não-infectadas, que permanecem de cor branca (Messing, 1983).

Outra característica importante em phage display é que tal metodologia utiliza protocolos curtos de seleção, uma vez que o sobrenadante das culturas infectadas pode ser utilizado diretamente nos processo de seleção. Tal fato dispensa a transferência para membranas que, além de limitar o número de clones, poderia ser um processo mais trabalhoso (Brigido & Maranhão, 2002).

O avanço tecnológico no campo das microtecnologias permitiu a abertura de novos campos na bioquímica analítica e no desenvolvimento de plataformas de detecção. A vantagem de se explorar técnicas baseadas em microrreações é o uso de pequenos volumes de reagente, menor produção de resíduos tóxicos, aumento do número de análises por unidade de volume, análises mais rápidas e, por fim, uma relação custo-eficácia efetiva (Härmä et al., 2000). Muitos ensaios e testes diagnósticos têm utilizado partículas de tamanho de submicron ou em microesferas (beads), em substratos ou suportes como base para as reações imunológicas com vistas à pesquisa diagnóstica. Microesferas ou beads são partículas de polímeros esféricos de diferentes tamanhos e compostos por diversos materiais, tais como poliestireno ou sílica. Por apresentarem superfícies ativadas com diversos grupamentos químicos, tornam essas partículas adequadas para a ligação a uma infinidade de compostos. Depois de ativadas, podem ser preparadas para o acoplamento de ligantes. A adsorção de um ligante é um

27 processo em que vários fatores físico-químicos estão envolvidos. A quantidade e o modo no qual o ligante é adsorvido dependem da natureza do mesmo, das características da superfície sólida e das condições da solução tamponante (Peula-Garcia et al., 2002). Microesferas magnéticas têm sido amplamente utilizadas em diagnóstico e pesquisa básica para captura de biomoléculas e células. Tipicamente, exibem propriedades super- paramagnéticas, em que há magnetização apenas na presença de um campo sem, contudo, permanecerem magnetizadas quando há a remoção do mesmo (Camilo, 2006). A utilização de beads magnéticos acoplados a microesferas permite ampla variedade de separação e manipulação biomagnética. A superfície hidrofílica garante excelente habilidade de dispersão e baixas interações inespecíficas. Por apresentarem um pequeno tamanho (2,8 micrômetros - μm) e uma ampla área de superfície (2-5 metro ao quadrado por grama - m2_{/g), tornam-se particularmente adequados para o isolamento}

de proteínas de uma amostra, para a realização de bioensaios e para a seleção de ligantes de afinidade (Wheatley; Schmidt Jr, 1999).

Já o acoplamento do bacteriófago M13 nos beads ocorre na região N-terminal da proteína do capsídeo. De acordo com Straus (2007), o bacteriófago possui aproximadamente 60 angstrons (Å), com diâmetro e 1 a 2 micrômetros (μm) de comprimento. O capsídeo proteico apresenta estrutura de uma concha helicoidal, formada por milhares de subunidades contendo, cada qual, 50 resíduos idênticos formando a principal proteína que protege o DNA central, sendo que a parte N-terminal encontra-se para fora do capsídeo e a porção C-terminal é voltada para o interior do mesmo, interagindo com o material genético. Dessa forma, a possibilidade de se desenvolver associações múltiplas através da interação entre antígenos selecionados por phage display, quando de sua conjugação às microesferas magnéticas, seguido da seleção por uso de anticorpos séricos; poderia possibilitar o achado de resultados com rapidez, efetividade e baixo custo.

A originalidade deste projeto está apoiada na associação da técnica de phage display a um sistema de beads, ainda não usado em estudos biológicos em leishmanioses; e na validação de epitopos selecionados por phage display ocmo candidatos à vacina contra a infecção por L. infantum.

28 OBJETIVOS

29 3. OBJETIVOS

3.1. OBJETIVO GERAL DA TESE

Identificar clones de bacteriófagos, por meio da técnica de phage display, que expressam epítopos de interesse em seus capsídeos virais, para serem avaliados como candidatos à vacina em camundongos BALB/c contra as leishmanioses e também como plataforma de diagnóstico sorológico diferencial.

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS DO MANUSCRITO 1

 Purificar anticorpos da classe IgG de cães com leishmaniose visceral (LV) sintomática e assintomática, e de animais não-infectados; e acoplar tais anticorpos às microesferas de proteína-G composto por um sistema de beads magnéticos.  Realizar os ciclos de bio-pannings para a seleção dos clones de bacteriófagos

expressando, em sua superfície, epitopos que forem reconhecidos apenas pelos anticorpos purificados dos soros de cães com LV.

 Estimular culturas de esplenócitos de camundongos BALB/c sadios ou infectados com L. infantum com os clones de bacteriófagos anteriormente selecionados, a fim de identificar aqueles que fossem capazes de induzir à maior proporção entre IFN- e IL-4 nos sobrenadantes das culturas celulares;

 Extrair e sequenciar o DNA dos clones de bacteriófagos selecionados nos experimentos de imunoestimulação in vitro, com vistas à identificação das sequências dos epitopos exógenos.

 Analisar a homologia dos peptídeos selecionados frente às sequências primárias de proteínas do parasita Leishmania spp.

 Imunizar camundongos BALB/c com os clones de fagos selecionados, associados à saponina, como adjuvante; e avaliar a resposta imune celular e humoral induzida após a imunização, por meio da dosagem das citocinas IFN-, IL-12, GM-CSF, IL-4 e IL-10, e determinação dos níveis de anticorpos IgG1 e IgG2a específicos aos clones.

30  Infectar os animais imunizados com formas promastigotas em fase estacionária de crescimento de L. infantum e avaliar o grau de proteção por meio da determinação da carga parasitária no baço, fígado, linfonodo drenante e medula óssea dos animais.

 Avaliar a resposta imune celular e humoral nos animais após o desafio, por meio da dosagem de citocinas IFN-, IL-12, GM-CSF, IL-4 e IL-10 e determinação dos níveis de anticorpos IgG1 e IgG2a específicos aos parasitas.