Tempo de retenção

A posição do pico é deteminada pela velocidade da fase móvel e pelo fator de retenção (k), ou seja, pela relação de distribuição de massa (m) do analito entre as fases líquida e gasosa conforme a Equação (7):

gas liq

m m

k = (7)

Sua relação com o tempo de retenção está na Equação (8): k

t t

t_R = _M + _M (8) Onde o tempo de retenção (t_R) é o tempo transcorrido do momento da injeção da amostra até a altura máxima do pico. Este tempo é característico das propriedades do analito, da fase estacionária, do fluxo de gás de arraste e da temperatura de separação, ou seja, das condições cromatográficas. Por isso, em condições reprodutíveis, o tempo de retenção é um parâmetro importantíssimo, pois possibilita a identificação de um composto. O tempo morto (t_M) é o tempo transcorrido do momento da injeção até obter-se um pico de um composto não retido, ou seja, é o tempo que a fase móvel leva para percorrer o caminho entre a injeção e a detecção (LANÇAS, 1993).

Nota-se que o tempo de retenção (t_R) na Equação (9) é simplesmente a soma dos tempos em que o analito permanece nas fases móvel t_M e estacionária

R t' : R M R t t t = + ' (9)

Assim, o tempo de retenção ajustado (t'_R) pode ser medido do pico de um composto não retido, por exemplo, ar, até o tempo de retenção do analito.

O fator de retenção ou fator de capacidade (k) pode ser relacionado com a constante de distribuição (K), Equação (10), que é a constante termodinâmica que mede a solubilidade da amostra na fase líquida. Assim:

β k K = (10) Onde liq gás v v =

β (relação das fases) (11)

Então, gas liq C C K = (12)

Esta solubilidade é afetada pela temperatura, e geralmente, um aumento na temperatura provoca uma diminuição do valor de K e consequentemente uma diminuição do tempo de permanência do analito na fase líquida, o que leva a diminuição dos tempos de retenção em cromatografia gasosa.

Outro fator importante na determinação da posição do pico é o volume de retenção (V_R) que representa o volume de gás de arraste desde o momento da injeção até a eluição. Veja a relação na Equação (13):

Fc t

V_R = _R (13)

Onde Fc significa fluxo constante

O mesmo conceito de tempo de retenção ajustado e tempo morto, pode ser utilizado para obtenção do volume de retenção ajustado e volume morto de gás de arraste.

O fator de retenção, Equação (14), conhecido também como fator de separação, α , é a relação do tempo de retenção ajustado entre dois picos, sendo proporcional aos coeficientes de partição:

A t B t R R ' ' = α (14)

A utilidade deste conceito é fornecer a seletividade da fase estacionária em relação a dois componentes. Quanto maior o valor de α maior será a seletividade da fase estacionária e melhor será a separação dos compostos.

2.6.1.3. Eficiência

De acordo com os princípios fundamentais da cromatografia, a amostra injetada na forma de um estreito perfil de concentração no momento da injeção, sofre um alargamento gradual à medida que realiza partição entre as fases na coluna cromatográfica. Este efeito toma a forma de uma distribuição normal, ou gaussiana, e aumenta em função do tempo de permanência do analito na coluna (LANÇAS, 1993).

Assim, o conceito de eficiência de separação está relacionado ao tempo de retenção (t_R) e a largura do pico (wb). A eficiência da coluna é tratada em temos de

número de pratos teóricos (N). Um prato teórico é definido com sendo um equilíbrio de distribuição do soluto entre duas fases. Assim, quanto maior o número de equilíbrios melhor será separação. A relação matemática que define o número de pratos teóricos foi descrita, Equação (15), por LANÇAS (1993):

2 16 _⎟⎟ ⎠ ⎞ ⎜⎜ ⎝ ⎛ = b R w t N (15)

Nos casos onde é difícil estabelecer a largura do pico na base (wb) pode-se

calcular (N) a partir da largura do pico na meia-altura (wh), Equação (16): 2 545 , 5 ⎟ ⎠ ⎞ ⎜ ⎝ ⎛ = wh t N R ₍₁₆₎

Uma variação deste conceito é o número de pratos teóricos efetivos (Neff),

Equação (17), a partir do tempo de retenção ajustado (t'_R):

2 ' 16 _⎟⎟ ⎠ ⎞ ⎜⎜ ⎝ ⎛ = b R eff w t N = 2 ' 545 , 5 ⎟ ⎠ ⎞ ⎜ ⎝ ⎛ wh t _R (17)

Os fatores operacionais de uma coluna podem ser mais bem avaliados por seu efeito sobre a altura equivalente a um prato teórico (H), equação (18):

N L

H = (18) Onde L é o comprimento da coluna

Assim, H é o comprimento necessário de uma coluna para gerar um prato teórico. Quanto maior N, menor H.

A eficiência de separação está relacionada com a difusão do analito na fase móvel, com o tempo de equilíbrio do analito entre as fases e com as diferentes trajetórias percorridas pelo analito. A velocidade linear média da fase móvel está relacionada com a eficiência da separação. Estas constatações geraram uma equação que explica os principais conceitos envolvidos neste fenômeno, chamada equação de van Deemter.

Uma simplificação dos estudos realizados por van Deemter pode ser demonstrada a seguir, Equação (19) (LANÇAS, 1993; HARRIS et al., 2001).

μ μ C B A H = + + (19) Onde:

H = Altura equivalente a um prato teórico

A = Efeito dos múltiplos caminhos (fase estacionária) B = Difusão molecular (longitudinal)

C = Resistência a transferência da massa (tempo de equilíbrio)

μ = Velocidade linear média do gás de arraste = L/tM

Os termos A, B e C são constantes de uma dada coluna. Veja na Figura 2, o gráfico experimental da curva de van Deemter:

Figura 2 – Curva de van Deemter (HARRIS et al., 2001)

A difusão molecular (B) pode ser explicada como a migração de soluto de um meio de maior concentração dentro da banda para um meio de menor concentração nas extremidades. A variância resultante da difusão, Equação (20) é expressa por:

t D_m 2

2 =

Onde Dm é o coeficiente de difusão do soluto na fase móvel e t é o tempo.

Assim, uma diminuição na velocidade linear do gás de arraste ocasiona maior dispersão do soluto. Por outro lado, um aumento na densidade do gás de arraste, seja pelo aumento de sua massa molecular ou pela sua pressão, causa uma diminuição na difusão do soluto e aumento da eficiência.

Como a difusão longitudinal de um gás é muito mais rápida que a de um líquido a taxa ótima de fluxo na cromatografia gasosa é maior do que na cromatografia líquida.

A seguir, na Figura 3, é possível visualizar este efeito:

Figura 3 – Efeito de difusão longitudinal (HARRIS et al., 2001)

O temo C é proveniente do limite de tempo necessário para o soluto estar μ em equilíbrio entre as fases móvel e estacionária. A Equação (21) descreve esta relação é:

(

k

)

De kd C ₂ 2 1 + = μ (21)

Onde D é o coeficiente de difusão do soluto na fase estacionária d é a _e espessura da fase estacionária e k é o fator capacidade. Assim, quanto maior for a espessura da fase estacionária menor será a eficiência da coluna, já que o termo está relacionado com a transferência de massa do soluto entre as fases. A Figura 4 demonstra a transferência de massa:

Figura 4 – Efeito de transferência de massa (HARRIS et al., 2001)

O termo A da equação de van Deemter refere-se à diferentes caminhos percorridos pelas moléculas do soluto na fase estacionária. A Figura 5 mostra como isto acontece.

Figura 5 – Efeito de caminhos múltiplos (HARRIS et al., 2001)

Estes efeitos sobre a altura do prato independem do fluxo do gás de arraste e podem ser descritas em função a seguinte Equação (22):

p

d

H =2λ (22)

Onde λ é o fator relacionado com as irregularidades do recheio e d diâmetro _p médio das partículas de suporte. Em colunas tubulares abetas, este último termo não tem efeito o que a torna muito mais eficiente. Neste tipo de coluna, a resistência ao fluxo de gás de arraste é obtida pelo grande comprimento da coluna e pequeno

diâmetro, já que não há recheio que promova um aumento de pressão e taxa de fluxo linear (HARRIS et al., 2001).

2.6.1.4. Resolução

A resolução é uma combinação de características de posição e de dispersão dos picos de eluição. Assim, quanto maior a diferença entre os tempos de retenção de picos adjacentes, melhor será a separação. Por outro lado, quanto mais largos forem os picos, pior será separação (HARRIS et al., 2001).

Desta forma, a resolução é, provavelmente, o parâmetro cromatográfico mais observado em desenvolvimento de métodos qualitativos e principalmente quantitativos. A teoria envolvida na determinação da resolução está baseada na forma gaussiana dos picos e em função de seus desvios padrão. Na Figura 6 está representado o pico cromatográfico e suas relações estatísticas (HARRIS et al., 2001).

Figura 6 – Relação estatística do pico cromatográfico (HARRIS et al., 2001)

De acordo com a Figura 6, é possível observar que a largura do pico à meia altura equivale a 2,35σ, enquanto a largura do pico na base é de 4σ. Estes valores estão relacionados com um fator de abrangência de 95,45% da área do pico e equivale à resolução igual à unidade. Na figura 7 estão representadas graficamente a resolução de duas situações (HARRIS et al., 2001)

Figura 7 – Representação gráfica da resolução (HARRIS et al., 2001)

Então, a resolução é a medida quantitativa da separação de dois picos consecutivos. Assim, a variação dos tempos de retenção Δt_R e a largura na base w _b são empregadas na Equação (23), da resolução:

(

1 2

)

2 b b R w w t Rs + Δ = (23)

A utilização da largura a meia altura (wh) será possível considerando 2,35σ ao

invés de 4σ. O que resultará na Equação (24):

(

1 2

)

18 , 1 h h R w w t Rs + Δ = (24) 2.7. Espectrometria de massas

As contribuições para a formação de conceitos físico-químicos que possibilitaram o desenvolvimento da espectrometria de massas não são recentes. De acordo com os estudos de Faraday, em 1833, e posteriormente de Thompson e Millikan sobre a natureza das partículas, surge o fundamento principal da técnica: a medida da relação massa/carga (m/z). Assim, a partir de conhecimentos de eletrostática, da lei de Lorentz, e de mecânica clássica foi possível construir

instrumentos para controlar as trajetórias de íons em campos elétricos e magnéticos (USP, 2007).

O impacto da espectrometria de massas para a química geral e fundamental rendeu o Prêmio Nobel em 1922 para Francis William Aston pela invenção do espectrômetro de massas e mais recentemente, em 2002, para John Fenn pelos estudos da ionização “electrospray” que possibilitaram aplicações às macromoléculas biológicas elucidando informações estruturais sem precedentes (QMC, 2007). Porém, embora sejam significativas as contribuições da espectrometria de massas, os acoplamentos com técnicas cromatográficas foram fundamentais para o desenvolvimento da química analítica ambiental. Atualmente a espectrometria de massas é considerada indispensável para identificação de pesticidas em amostras ambientais e no atendimento dos limites máximos permitidos estipulados pela União Européia e outros organismos legislativos que limitam a presença de pesticidas (FERNANDEZ-ALBA, 2005).

No documento Desenvolvimento e validação de método utilizando SPE E GC-MS para a determinação multirresíduo de pesticidas em água potável (páginas 53-62)