Teor e perfil das isoflavonas

Os produtos analisados neste trabalho também foram caracterizados em relação ao conteúdo de isoflavonas e o seu perfil de distribuição. Os cromatogramas estão em anexo (Apêndice 1). A Figura 5 apresenta os resultados referentes ao teor de isoflavonas presente nas amostras.

Figura 5 – Conteúdo total e perfil de isoflavonas (% b.u.) dos produtos à base de soja e/ou derivados.

Quibe e salsicha foram as amostras que apresentaram maiores teores de isoflavonas. Através do teste de correlação, obteve-se um r = 0,60, podendo-se afirmar que houve uma correlação positiva entre o teor de isoflavonas e o conteúdo protéico dos produtos (Figura 6).

Figura 6 – Correlação entre o teor de proteína e o conteúdo total de isoflavonas dos produtos à base de soja e/ou derivados.

Em produtos à base de soja, espera-se que haja alta correlação linear entre conteúdo protéico e teor de isoflavonas. Isso porque, em geral, a maior parte da proteína presente nestes alimentos provém dos derivados da soja, os quais também são ricos em isoflavonas. No entanto, em alguns produtos analisados neste trabalho, como a lasanha e o ravioli, houve a adição de outros ingredientes fontes de proteína, como queijo, leite e ovo, além dos derivados da soja, o que poderia contribuir para uma diminuição no coeficiente de correlação de Pearson entre essas variáveis.

Além disso, foram utilizados diferentes derivados de soja (como concentrado, isolado, proteína texturizada) na formulação desses produtos, os quais são as principais fontes de proteína nesses alimentos, mas apresentam concentração de isoflavonas bastante variável. Essa variação ocorre em função da matéria-prima e do processamento empregados na fabricação dos derivados da soja.

Embora seja utilizada a proteína texturizada de soja como ingrediente na maioria dos produtos, a variação no teor de isoflavonas poderia ser explicada pela diferença no

Doce de “leite” Chocolate Estrogonofe Cookies A Cookies B Ravioli Hambúrguer Lasanha Empanado Pão Nuggets A Barra de cereal Nuggets B Quibe Salsicha

conteúdo desses compostos na matéria-prima (GENOVESE; LAJOLO, 2002). Coward et al. (1998) afirmam que a presença e a concentração das isoflavonas nos derivados protéicos da soja dependem das condições de processamento, principalmente a temperatura de tratamento do material. Além disso, estudos sugerem que as formas químicas e o teor de isoflavonas têm um impacto significativo sobre a biodisponibilidade e os efeitos biológicos atribuídos a esses compostos (ZHANG et al., 2003).

A barra de cereais, o hambúrguer e o biscoito do tipo cookies da marca A são produzidos a partir da proteína isolada de soja (Quadro 2). O percentual de agliconas (25-38%) determinado nesses produtos foi similar ao encontrado por Genovese et al. (2007) no isolado protéico (31%). O elevado conteúdo desses compostos é resultado da ação das β-glicosidases endógenas do grão durante o processo de extração, as quais hidrolisam os β-glicosídeos transformando-os em agliconas.

Em relação aos nuggets (marcas A e B) quibe e salsicha, produzidos a partir da proteína texturizada de soja, foram obtidos teores de acetilglicosídeos entre 2 e 13%. Esses compostos são comumente formados durante a tostagem da farinha de soja ou a extrusão para obtenção da proteína texturizada (GENOVESE; LAJOLO, 2002). O conteúdo de acetilglicosídeos é menor (cerca de 6%) quando este ingrediente é obtido a partir de um concentrado protéico e é maior (cerca de 33%) se o produto for produzido a partir do hipocótilo. Considerando o perfil encontrado, pode-se inferir que os produtos citados foram produzidos a partir de uma proteína texturizada obtida de um concentrado protéico de soja. O teor de agliconas (49 - 52%) obtido para esses produtos também foi similar ao relatado por Genovese et al. (2007) (44 - 59%).

Genovese et al. (2007) analisaram diversos produtos texturizados de soja obtidos da farinha desengordurada, concentrado protéico e da farinha do hipocótilo. Observou- se que entre as amostras produzidas a partir do concentrado protéico, há predomínio das agliconas sobre as outras formas glicosiladas. Para as amostras produzidas a partir da farinha desengordurada, predominam os β-glicosídeos. A farinha de hipocótilo texturizada apresenta um perfil de isoflavonas diferenciado em comparação aos outros tipos de texturizados, com um conteúdo total de isoflavonas muito superior, baixo teor de agliconas, elevado teor de β-glicosídeos e expressivo conteúdo de acetil conjugados.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Isolado A Isolado B Texturizada A

Texturizada B b-glicosídeos Malonil Acetil Agliconas

A Figura 7 apresenta o conteúdo de isoflavonas de alguns dos ingredientes utilizados como matéria-prima na fabricação dos produtos.

Figura 7 - Conteúdo total de isoflavonas (mg/100 g b.u.) dos derivados protéicos de soja utilizados como ingredientes em alguns dos produtos analisados.

A proteína vegetal hidrolisada aparece como ingrediente em vários dos produtos analisados. Pode ser obtida a partir do milho, da soja ou do trigo e é decomposta em aminoácidos mediante um processo de hidrólise ácida ou enzimática. Sua função como matéria-prima relaciona-se à incorporação de sabor em produto salgados. A análise deste ingrediente demonstrou que o seu emprego não interfere no conteúdo ou no perfil de isoflavonas, já que estes compostos não foram detectados no produto.

É importante considerar que além do processamento para a produção dos derivados da soja utilizados como matéria-prima, os produtos foram submetidos a condições diversas em seus diferentes processos de fabricação, as quais também poderiam contribuir para alterações no perfil das isoflavonas.

Genovese e Lajolo (2002) relatam que o teor reduzido de malonilglicosídeos e elevado de agliconas, como foi encontrado nos nuggets (marca B), no quibe e na salsicha, indicam condições de processamento mais drásticas. Quando o perfil contrário

0% 20% 40% 60% 80% 100% Barr a de cere al Choc olat e Cook ies A Cook ies B Doce de "l eite " Em pana do Estro gono fe Ham búrgu er Lasan ha Nugge ts A Nugg ets B Pã o Qui be Ravi oli Sals icha P o rc en ta ge m de a g li c o na s

DAIDZEÍNA GLICITEÍNA GENISTEÍNA

é observado, no caso da lasanha, presume-se que as condições de processamento do produto foram menos drásticas.

Zhang et al. (2003) encontraram um perfil de distribuição das isoflavonas semelhante em amostras de pão à base de soja, com predomínio dos β-glicosídeos. Embora as isoflavonas não sejam destruídas pelo calor empregado no processamento dos alimentos, o aquecimento causa alterações no perfil das isoflavonas nos produtos (WANG; MURPHY, 1996). O tratamento térmico utilizado na fabricação do pão promove a conversão (desesterificação) dos malonilglicosídeos em β-glicosídeos, compostos mais termoestáveis (FARAJ; VASANTHAN, 2004).

Em relação à distribuição das agliconas, os derivados de genisteína, seguidos pelos de daidzeína, predominaram em todos os produtos. O mesmo perfil foi encontrado por Barbosa e colaboradores (2006 a), em todos os derivados protéicos analisados. Esses dados são apresentados na Figura 8.

Figura 8 - Perfil de distribuição das isoflavonas agliconas (%) nos produtos à base de soja e/ou derivados.

O Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA, 2007) foi responsável pela publicação da primeira base de dados contendo informações referentes ao conteúdo de isoflavonas de diversos alimentos.

Quanto à salsicha e aos nuggets, os valores disponíveis na tabela consultada são inferiores aos encontrados em nosso trabalho. Tal diferença pode ser atribuída à composição dos produtos analisados pelo USDA, os quais apresentam a proteína de soja como substituto parcial da carne. Dessa forma, espera-se que o teor de isoflavonas seja menor que o encontrado em produtos contendo somente a proteína vegetal como fonte protéica.

O hambúrguer analisado pelo USDA não apresenta carne em sua composição (substituição total por proteína de soja). O seu conteúdo de isoflavonas foi o dobro do encontrado em nossa amostra, a qual contém apenas derivados da soja como fonte protéica. Wang e Murphy (1994 a) afirmam que a variedade do grão, a época de colheita e a localização geográfica afetam o teor de isoflavonas e contribuem para a variabilidade no conteúdo desses compostos nos alimentos contendo soja ou seus derivados. Além disso, o hambúrguer contém como ingrediente o isolado protéico e a proteína concentrada texturizada. Dados disponíveis na tabela da USDA demonstram que o concentrado protéico obtido por extração alcoólica apresenta cerca de 90% menos isoflavonas que o obtido por extração em solução aquosa (USDA, 2007). Assim, se o concentrado protéico utilizado como ingrediente no hambúrguer foi obtido por meio de extração alcoólica, a sua contribuição no teor de isoflavonas seria muito pequena, o que explicaria o baixo teor desses compostos no produto analisado.

O teor de isoflavonas nesses produtos é consideravelmente menor do que em outros derivados da soja. Esse perfil era esperado em virtude da utilização de diversos ingredientes, além da soja, na produção desses alimentos. A adição desse grão ou seus derivados pode ocorrer em substituição à proteína animal, ou ainda, para reduzir o conteúdo de gordura dos produtos. No entanto, o emprego desses ingredientes deve ser limitado visando à manutenção da similaridade aos produtos convencionais (HUTABARAT et al., 2001).

4.1.3 Determinação da capacidade antioxidante in vitro

A capacidade antioxidante dos alimentos industrializados contendo soja e/ou seus derivados protéicos foi avaliada por meio de três métodos diferentes: capacidade

redutora do Folin-Ciocalteu, sequestro de radicais livres do DPPH e capacidade de absorção do radical oxigênio (ORAC). Os resultados referentes aos dois primeiros métodos citados estão apresentados na Tabela 2.

Tabela 2 - Capacidade antioxidante dos produtos industrializados à base de soja e/ou derivados determinada por meio dos métodos de capacidade redutora do Folin- Ciocalteu (mg equivalentes de catequina/100 g amostra b.u.) DPPH (μmoles equivalentes de trolox/100 g amostra b.u.).

AMOSTRAS FOLIN CIOCALTEU DPPH

Barra de cereal com soja e mel 118 ± 5b _{81 ± 4}c

Chocolate à base de soja 575 ± 28a

998 ± 10a

Cookies de soja A 65 ± 2e

30 ± 1g

Cookies de soja B 51 ± 1f

24 ± 1h

Doce de “leite” de soja 71 ± 3d

59 ± 5e

Empanado vegetal recheado com champignon 57 ± 2f 31 ± 1g

Estrogonofe vegetal 32 ± 2h 20 ± 2h

Hambúrguer vegetal 43 ± 2g 11 ± 1i

Lasanha de soja 67 ± 2e 31 ± 1g

Nuggets de soja A 46 ± 2f,g _{18 ± 1}h

Nuggets de soja B 57 ± 2f _{11 ± 1}i

Pão de soja light 89 ± 3c _{38 ± 3}f

Quibe vegetal 72 ± 4d _{87 ± 1}b

Ravióli com molho de soja 38 ± 1g,h _{21 ± 1}h

Salsicha vegetal 59 ± 1f _{75 ± 4}d

Resultados expressos como média ± desvio-padrão (triplicata).

Médias na mesma coluna com letras diferentes são significativamente diferentes (p<0,05).

De modo geral, observa-se que o chocolate apresentou a maior capacidade antioxidante entre todas as amostras. Em relação à capacidade redutora do Folin- Ciocalteu, a do chocolate também foi a maior, cerca de cinco vezes superior à da barra de cereais, a qual também se destacou em relação aos outros produtos.

Os métodos analíticos para a determinação da capacidade antioxidante são numerosos e podem estar sujeitos a interferências, além de se basearem em fundamentos diversos. Dessa forma, atualmente preconiza-se a utilização de duas ou mais técnicas, já que nenhum ensaio usado isoladamente para determinar a capacidade antioxidante irá refletir exatamente a “capacidade antioxidante total” de uma amostra (HUANG et al., 2005; PRIOR et al., 2005).

O método do DPPH foi primeiramente descrito por Brand-Williams et al. (1995). Baseia-se na habilidade redutora dos antioxidantes, presentes na amostra, sobre o DPPH•, um radical orgânico estável, através de uma reação de transferência de elétrons, a qual é medida através do decréscimo da absorbância a 517 nm.

Em relação aos ingredientes protéicos, a proteína vegetal hidrolisada e a proteína texturizada foram avaliadas quanto à capacidade redutora do Folin-Ciocalteu e capacidade sequestrante do radical DPPH•. Foram encontrados valores expressivos para a proteína vegetal hidrolisada para os dois métodos de determinação da capacidade antioxidante (1684 ± 15 mg equivalentes de catequina/100 g e 2640 ± 40 µmoles equivalentes de Trolox/100 g, respectivamente). Para a proteína texturizada, os valores foram 40,9 ± 0,3 mg equivalentes de catequina/100 g e 46 ± 2 µmoles equivalentes de Trolox/100 g, respectivamente.

É importante considerar que o reagente de Folin-Ciocalteu, também empregado para determinar o conteúdo de fenólicos totais, não é específico para esses compostos e pode ser reduzido por outros, tais como o ácido ascórbico, aminas alifáticas terciárias, Cu (I), açúcares redutores, aminoácidos aromáticos (triptofano e tirosina), formando o complexo azul de molibdênio (GAHLER et al., 2003).

Foi realizada ainda a determinação da capacidade antioxidante de dois produtos convencionais, hambúrguer e salsicha, para verificar o impacto da substituição da carne por derivados protéicos da soja sobre este parâmetro. Observou-se que as amostras apresentaram a capacidade redutora do Folin-Ciocalteu similar (71 ± 1 e 61 ± 1 mg equivalentes de catequina/100 g b.u., respectivamente) à maioria dos produtos à base de soja e/ou derivados analisados. Quanto à capacidade sequestrante do DPPH•, os produtos convencionais apresentaram valores maiores (144 ± 2 e 129 ± 1 µmoles equivalentes de Trolox/100 g b.u., respectivamente) do que todos os produtos contendo

0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 Barra cere al Cho cola te Cook ies A Coo kies B Doc e de “leite ” Em pana do Estro gono fe Ham búrg uer Las anha Nug gets A Nugg ets B Pã o Quib e Rav ioli Sals icha C a pac ida de A nt iox idant e (u m o les eq. T ro lox /100 g b .u. )

TOTAL HIDRO LIPO

soja e/ou derivados, com exceção do chocolate (Tabela 4). Este fato pode ser atribuído à adição de eritorbato de sódio, um antioxidante utilizado comumente em produtos cárneos. Esse composto é um isômero sintético da vitamina C e é utilizado nas concentrações de 0,05% a 0,25%, as quais, conforme verificado, interferem no método de Folin-Ciocalteu e reduzem o DPPH•.

Na Figura 9 estão apresentados os dados de capacidade antioxidante obtidos pelo método de ORAC. Este método foi desenvolvido por Glazer (1988) e modificado por Cao et al. (1993). Em 1995, o método de ORAC foi semiautomatizado utilizando o sistema COBAS FARA II por Cao e colaboradores (1995). É um método muito sensível e verifica a capacidade sequestradora de um antioxidante frente à formação de um radical peroxila induzido pelo AAPH a 37ºC. O radical peroxila reage com um composto fluorescente e forma um produto não fluorescente. O efeito protetor de um antioxidante é verificado calculando-se a área sob a curva de decaimento da fluorescência da amostra versus tempo, comparada ao controle, que não apresenta antioxidante (Figura 4B).

Figura 9 - Capacidade antioxidante total e das frações hidrofílica e lipofílica dos produtos contendo soja e/ou derivados, determiada por meio do método da capacidade de absorção do radical oxigênio (µmoles equivalentes de Trolox/100 g de amostra b.u.).

O método do ORAC, no entanto, foi recentemente automatizado e requer para tanto um sistema multicanal para a dispensação de reagentes acoplado a um leitor de fluorescência de microplaca com 96 cavidades. Dessa forma, a análise torna-se extremamente cara e possível em apenas poucos laboratórios (CAO et al., 1995). Neste estudo, o método foi adaptado para uso manual com leitura em espectrofotômetro de fluorescência simples, e comprovou ser extremamente sensível e passível de ser utilizado em pequenos laboratórios de pesquisa.

Em relação aos resultados obtidos por meio desse ensaio, chocolate foi a amostra que mais se destacou.

Os antioxidantes hidrofílicos correspondem a mais de 85% do total de compostos antioxidantes dos vegetais (PRIOR, 2003). Nos produtos analisados, a fração hidrofílica correspondeu a 84-99% da capacidade antioxidante total. O mesmo perfil foi observado em estudo realizado por Eberhardt e colaboradores (2005), em que os compostos hidrofílicos corresponderam a 76-92% da capacidade antioxidante total.

De modo geral, houve uma correlação significativa entre os valores de capacidade antioxidante determinados pelos métodos de Folin-Ciocalteu, DPPH e ORAC. A Tabela 3 apresenta os coeficientes de correlação entre os métodos testados, incluindo as frações hidrofílica (ORAC-H) e lipofílica (ORAC-L) do ensaio do ORAC.

Tabela 3 - Coeficientes de correlação de Pearson (r) entre os diferentes métodos empregados para determinação da capacidade antioxidante dos alimentos à base de soja e/ou produtos derivados.

METODOLOGIAS COEFICIENTE DE CORRELAÇÃO (r)

Folin-Ciocalteu x DPPH 0,99 Folin-Ciocalteu x ORAC 0,97 Folin-Ciocalteu x ORAC-H 0,97 Folin-Ciocalteu x ORAC-L 0,92 DPPH x ORAC 0,97 DPPH x ORAC-H 0,97 DPPH x ORAC-L 0,91

Várias publicações apresentam correlação linear excelente entre a capacidade redutora do Folin-Ciocalteu e a atividade antioxidante, obtida pelo método do DPPH•. Este fato se deve principalmente à similaridade entre os mecanismos de ação envolvidos nos dois métodos, ou seja, a transferência de elétrons (HUANG et al., 2005).

Já o método de ORAC se baseia na transferência de átomos de hidrogênio do antioxidante para o radical AAPH (PRIOR et al., 2005). Esse ensaio foi originalmente desenvolvido para mensurar a capacidade antioxidante hidrofílica, uma vez que é empregado um gerador de radical hidrofílico e um detector hidrofílico. Modificações têm sido feitas para melhorar a sensibilidade do método por meio da utilização de um novo indicador e um componente específico para potencializar a solubilidade de antioxidantes lipofílicos, proporcionando uma estimativa mais completa da capacidade antioxidante total das amostras. Entretanto, espera-se que a fração lipofílica (ORAC-L) não demonstre boa correlação com outros métodos de determinação da capacidade antioxidante, pelo fato de que estes não são aptos a mensurar a capacidade antioxidante dos compostos lipossolúveis (EBERHARDT et al., 2005).

Alguns trabalhos relatam também a correlação existente entre o conteúdo de isoflavonas e a capacidade antioxidante em alimentos à base de soja. A Tabela 4 apresenta os valores de coeficiente de correlação de Pearson entre esses parâmetros.

Tabela 4 - Coeficientes de correlação de Pearson (r) obtidos entre a capacidade antioxidante determinada por diferentes métodos e o conteúdo de isoflavonas dos produtos contendo soja e/ou derivados protéicos.

METODOLOGIAS COEFICIENTE DE CORRELAÇÃO (r)

Isoflavonas x DPPH 0,24

Isoflavonas x Folin-Ciocalteu 0,22

Isoflavonas x ORAC 0,25

Não houve correlação entre estas variáveis nas amostras analisadas. Este fato pode ser explicado pela presença de outros ingredientes na composição destes alimentos, os quais também são ricos em compostos fenólicos com atividade

antioxidante. Entre eles, podem ser destacados o líquor de cacau e condimentos, além de antioxidantes sintéticos empregados como conservantes.