Teste dos anticorpos monoclonais

As proteínas originárias da extração e purificação foram inoculadas em camundongos para a produção dos monoclonais. As inoculações seguiram o esquema descrito no item 3.7. Feita a fusão e transcorridos dez dias, foi observado o crescimento de 25 clones e somente 17 continuaram crescendo. Estes são apresentados a seguir:

Placa dos clones contra a proteína de 19 kDa C3, D4, F4, E5, F5 e E5

Placa dos clones contra a proteína de 21 kDa B7, B2, F2, C3, D4, D7, E9, E10, D11, E11 e G11

Feitas 10 repetições do teste de ELISA, obteveram-se somente 3 clones que se apresentaram fracamente positivos que, são: C3 e E5 de 19 kDa e E10 de 21 kDa. Logo, este resultado pode ser observado na tabela 9A, onde foi utilizado sobrenadante de cultura de células, onde cada clone foi testado separadamente, e o controle positivo utilizado era o próprio soro, diluído numa proporção de 1:200, dos animais inoculados com a proteína sexo-específica de 19 e 21 kDa. O conjugado foi utilizado numa diluição de 1:2000 e o controle negativo numa diluição de 1:200, onde se utilizou soro de animais não inoculados.

Tabela 9A: Resultado do teste de ELISA para a determinação dos clones positivos. Clones Resultado do teste de ELISA 19 kDa 21 kDa E5 B7 D11 0,155 0,111 0,126 C3 B2 E11 0,162 0,136 0,110 D4 F2 G11 0,103 0,076 0,102 F4 C3 + 0,093 0,117 0,257 F5 D4 - 0,085 0,108 0,072 C6 D7 branco 0,122 0,101 0,071 + E9 branco 0,648 0,113 0,073 - E10 conjugado 0,071 0,162 3,588

5. DISCUSSÃO

A sexagem como um todo sempre despertou o interesse na comunidade científica desde a antiguidade até os dias de hoje e, dentro da Medicina Veterinária, há um grande interesse voltado para os animais de produção (bovino, ovinos e caprinos), esporte e lazer, como os eqüinos, e também quanto ao aspecto conservacionista de animais em extinção.

Neste trabalho, objetivando-se identificar antígenos sexo-específicos, purificaram-se membranas de leucócitos de animais de ambos os sexos. A escolha de leucócitos foi devido ao fato de ter sido anteriormente detectada a presença de antígenos sexo-específicos em leucócitos, visto que estas células foram responsáveis pela rejeição de enxertos de camundongos isogênicos, que se diferenciavam apenas pelo sexo (MÜLLER,1996).

A primeira parte do trabalho teve como base científica a pesquisa do antígeno H-Y presente nas células de machos e ausente nas de fêmeas, o que foi descrito por BRADLEY (1989), que mostrou em estudos imunohistoquímicos, utilizando soro com alto título de anticorpos, que o antígeno macho-específico estava presente em aproximadamente 50% dos espermatozóides, demonstrando que, num ejaculado, 50% dos espermatozóides são possuidores do cromossomo Y portando o antígeno HY, enquanto que os outros 50% são possuidores do cromossomo X e, portanto, não possuem o antígeno HY.

Foi feita uma migração eletroforética (gel de poliacrilamida SDS-PAGE 12%), onde, ao final, este gel foi corado e descorado de acordo com o descrito em material

e método no item 3.6 e, após esta etapa, o gel foi digitalizado, sendo depois a figura submetida ao programa GEL-PERFECT (BOZZO E RETAMAL 1991) de acordo com o descrito em material e método no item 3.5, onde o resultado desta análise teve como diferença 3 proteínas, sendo estas de 68 e 46 kDa para o material de macho e 35 kDa para fêmea. Este achado corrobora o que foi descrito por BRADLEY (1989); que existe diferença na constituição protéica do tecido de macho para fêmea, o que também vem corroborar com o que disse MÜLLER (1996); que o antígeno H-Y, como um antígeno de histocompatibilidade de macho, causa rejeição no transplante de pele de macho para fêmea da mesma linhagem de roedores, e o antígeno H-Y estar presente na membrana da maior parte das células dos machos.

Para a primeira parte do trabalho, não obtivemos resultados satisfatórios, pois os monoclonais produzidos a partir das proteínas de membrana de leucócitos não apresentaram resposta contra as proteínas de membrana de células espermáticas. Provavelmente, os antígenos sexo-específicos encontrados nas células leucocitárias apresentavam-se de forma ou composição diferentes daqueles encontrados nos espermatozóides. A composição das proteínas de membrana espermática variam entre células de acordo com o grau de maturidade, como demonstrado por RETAMAL et al. (2000).

Estes fatos talvez sejam os responsáveis pelo insucesso da produção do monoclonal a partir de proteínas de membrana de leucócitos. Partimos, então, para a segunda parte do trabalho, que foi a pesquisa do antígeno HY na membrana de espermatozóides. Embora sabendo da pouca antigenicidade do antígeno HY, e que muitos pesquisadores não obtiveram resultados satisfatórios na busca da sexagem dos espermatozóides, como já descrito por KOO (1981), que somente 30% das fêmeas de camundongos imunizadas produziam um soro com alto título de anticorpos anti HY, mesmo assim, achamos válida a pesquisa do antígeno HY em membrana de espermatozóides de eqüino.

Partindo do fato, relatado por EDIDIN e JOHNSON (1977), e COHEN e HENDRY (1978), de que inoculações de células espermáticas de várias espécies no coelho provocam a produção de anticorpos que puderam ser verificados in vitro a partir da aglutinação de espermatozóides, foi dado início, então, à segunda parte do trabalho.

Esta etapa foi a de determinar as proteínas sexo-específicas utilizando-se soro de camundongos e coelhos (macho e fêmea) e soro de égua através do teste de Western-blotting, verificando-se as bandas marcadas no papel de nitrocelulose.

Após as inoculações com as células espermáticas íntegras, soros de camundongos e coelhos (machos e fêmeas) e soro de égua foram testados por

western-blotting, quando foi verificada a presença de 3 proteínas, 19, 21 e 35 kDa, sendo que esta apresentação variava de acordo com o segundo anticorpo utilizado. Quando o imunobloqueio era realizado utilizando-se anticorpos de macho ou de fêmea, os resultados não variavam. Entretanto, quando o segundo anticorpo utilizado era proveniente de macho ou de fêmea, houve diferenças acentuadas. Se o segundo anticorpo utilizado era proveniente de animais de sexo masculino, observavam-se as três proteínas supracitadas, e quando o segundo anticorpo era proveniente de animais do sexo feminino, apenas a proteína de 21 kDa era evidenciada.

O fato da proteína de 21 kDa estar evidente de forma exclusiva quando o segundo anticorpo era proveniente de fêmeas, nos faz imaginar que esta proteína seja o antígeno HY ou macho específico. Em relação às proteínas de 35 kDa e de 19 kDa, estas provavelmente são evidenciadas pelo mau bloqueio produzido pelo anticorpo primário ou pelo não-reconhecimento do segundo anticorpo quando este era proveniente de fêmea, por se tratar de um antígeno fêmea específico.

Comparando-se os resultados obtidos neste trabalho com proteínas de membrana de leucócitos e de membrana de espermatozóides, podemos supor que a proteína de 35 kDa encontrada no material de membrana de leucócito de fêmea foi semelhante à proteína de 19 e 35 kDa encontrada na membrana de espermatozóides. Podemos, também, supor que a proteína de 19 kDa encontrada seria um monômero, enquanto que as proteínas de 35 kDa seriam um dímero desta. Já a proteína de 21 kDa, encontrada na membrana de espermatozóides, apresentava-se como monômero das proteínas de 46 e 68 kDa encontradas na membrana de leucócitos de machos.

Estas proteínas que foram determinadas como sexo-específicas para eqüino, são de fundamental importância para posteriores estudos da sexagem de espermatozóides, sendo necessário fazer subclonagens destes clones para uma melhor especificidade do anticorpo para com o antígeno.

6. CONCLUSÕES

1- Verificou-se a grande dificuldade da produção de monoclonais a partir de proteínas de membrana de leucócitos contra as proteínas sexo-específicas de membrana de espermatozóides de eqüino.

2- Verificou-se a baixa antigenicidade das proteínas sexo-específicas de eqüino. 3- Obteve-se a produção de três monoclonais contra a proteína de membrana de células espermáticas de eqüinos, sendo estes dois monoclonais para a proteína de 19 kDa e um monoclonal para a proteína de 21 kDa.