Teste cometa em mucosa bucal e em linfócitos de sangue periférico

Nos últimos anos o monitoramento dos efeitos genotóxicos de químicos em humanos com o objetivo de avaliar os riscos tem aumentado e como resultado tem sido identificado marcadores da exposição humana a mutágenos e carcinógenos. O biomonitoramento de populações humanas expostas aos agentes potencialmente mutagênicos e carcinogênicos pode providenciar informações iniciais de desrregulações celulares e iniciação do desenvolvimento de câncer. Nos recentes anos o teste do cometa, conhecido como eletroforese em gel de agarose tem sido importante biomarcador para avaliar danos em populações expostas ambientalmente ou ocupacionalmente a poluentes do ar, metais, agrotóxicos, radiações e outros xenobióticos (VALVERDE; ROJAS, 2009).

O teste cometa permite avaliar de maneira sensível a presença de lesões na fitas de DNA e, ainda, se as agressões estão sendo reparadas pela célula (VILLELA et al., 2003). Este teste, com pequenas modificações no protocolo, pode avaliar danos oxidativos nas bases nitrogenadas das fitas da dupla hélice. Devido a sua sensibilidade, rapidez, baixo custo e ampla aplicação, é frequentemente empregado em estudos tanto in vivo como in vitro, podendo ser aplicado a qualquer tecido sem a limitação da proliferação celular para a análise (DEHON et al., 2008).

O teste cometa teve o seu precursor desenvolvido por Östling e Johanson no ano de 1984, estes dois investigadores criaram um teste de avaliação genotóxica com células individualizadas submetida à lise e a uma corrente elétrica. Com o teste chamado na época de microgel, os investigadores eram capazes de analisar danos nas fitas do DNA, a coloração era fluorescente (GONTIJO; TICE., 2003).

A designação de teste cometa foi introduzida por Olive em 1988 devido à cauda que formava nos nucleóides lesados, mais tarde, no mesmo ano, este paralelo aos estudos de Singh viria a produzir modificações no ensaio que são usadas até hoje, criando doravante uma nova versão para o ensaio cometa, a alcalina (VALVERDE; ROJAS, 2009). Segundo Collins et al. (2008) o ensaio cometa é um excelente teste de genotoxicidade podendo revelar quebras simples, duplas quebras nas fitas do DNA, além de cross-links e sítios álcali-lábeis. Sendo

usualmente trabalhado para biomonitoramento ambiental, ocupacionais e mais recentemente para processos oxidativos do DNA, condicionados por espécies químicas de poder oxidativos extrínsecos (ingeridos na dieta) ou intrínsecos (gerado pelo processo de respiração celular) (VALVERDE; ROJAS 2009).

O ensaio cometa é uma técnica que envolve baixo custo, pequeno número de células e com boa sensibilidade pode ser empregado in vitro ou in vivo para detecção de fragmentos de DNA que migram na corrente. (HARTMANN, 2003; RIBEIRO et al., 2006; DEHON et al., 2008). O teste cometa (Tabela 4) tem aplicações na área biomédica, saúde ambiental e biomonitoramento humano a agentes tóxicos, avaliando danos ao DNA e estresse oxidativo (DUSINSKA; COLLINS, 2008).

A versão alcalina do teste usa a solução de lise e o tampão de eletroforese com um pH básico, este procedimento acaba por tornar o teste capaz de detectar lesões que não eram detectadas com a versão neutra do teste, como o sítio álcali-lábel. O pH alcalino desnatura as fitas do DNA e determinados sítios tornam se visíveis após a eletroforese e impregnação (GONTIJO; TICE, 2003).

O ensaio cometa não é um teste para avaliação de mutações, pois os danos detectados no teste podem ser recuperados pelos mecanismos de reparo celular. Este fato possibilita ao teste avaliar a capacidade de reparo em células eucarióticas (COLLINS, 2008).

Tabela 4. Uso e medidas com o teste cometa em diferentes estágios de biomonitoramento

Exposição

externa Exposição interna

Susceptibilidade individual Efeitos Consequência s Monitoramento do ambiente Biodisponibilidade Metabolismo Excreção Status antioxidantes Genótipo/fenótipo Reparo de DNA Metabolismo das enzimas de fase I/II

Função imune Enzimas antioxidantes Mutações Aberrações cromossômicas Apoptose Doenças Morte Contaminação ambiental e ocupacional Quebras de DNA Danos em bases Resistência à oxidação Capacidade de reparo Variações fenotípicas Reparo por excisão de bases

Reparo por excisão de nucleotídeos

Danos oxidativos

Doenças

Fonte: Adaptada de Gyorffy, 2008.

O teste do cometa também pode ser utilizado para estudos de reparo de DNA, visto que as lesões detectadas são passíveis de correção. Embora impossibilite inferir a fidelidade do processo de reparo, pode trazer informações importantes sobre a cinética e o tipo de lesão reparada (TICE, 2000; SILVA et al., 2003). A maquinaria de reparo é importante na prevenção para acumulação de danos ao DNA, e protege o organismo da incidência de câncer por excisão de nucleotídeos, de bases, e por recombinações (GILLET; SCHAERER, 2006).

Vários polimorfismos em genes de reparo, por excisão de nucleotídeos (XPD, XPG, XPC) e em reparo por excisão de bases (XRCC1, APE1, hOGG1), e em reparo de quebras duplas e por recombinação (XRCC3, NBS1) têm sido avaliados pela suas associações com genotoxicidade e risco de câncer (JIAO et al., 2007). A perda de reparo devido à redução na detecção do dano ou por deficiências nos mecanismos de reparo pode ser observada em um grande número de doenças genéticas, incluindo o câncer e, o não reparo de lesões ao DNA ou o reparo incorreto pode induzir as mutações que afetam os genes responsáveis pelo controle da divisão e diferenciação celular (NASCIMENTO et al., 2001).

Quando as células são expostas a agentes que lesam o DNA, genes críticos, a exemplo do gene p53 (Figura 3) atuam na parada do ciclo celular, promovendo um atraso para prover o tempo destinado ao reparo do dano antes da síntese replicativa do DNA. Uma disfunção nesses genes e falhas no reparo resulta na replicação de lesões mutagênicas, que, em acúmulo, favorecem as mudanças genéticas, incluindo transformações neoplásicas (MORI, 2002).

Figura 3. Mecanismo de ação de genes envolvidos em reparo de DNA, a exemplo do p53

Fonte: Adaptado de Mori, 2002.

Na ação antioxidante o desbalanço entre a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) e os antioxidantes presentes no organismo pode resultar em condições patogênicas. O dano oxidativo pode iniciar o processo de carcinogênese ou de aterosclerose. Na mitocôndria, esse dano pode afetar o DNA, causar mutações e comprometer a respiração celular, induzindo à falência mitocondrial. Além disso, a superprodução de ERO ( causada por disfunção mitocondrial) leva à abertura dos canais da membrana mitocondrial, que libera o citocromo C, o qual induz a morte celular apoptotica executada por enzimas (caspases), resultando em diferentes doenças, dependendo do tecido afetado. Os antioxidantes podem colaborar na prevenção desse processo, por meio da diminuição da injúria celular oxidativa, aumento ao estimulo a sistemas de defesa celular e proteção a oxidação do DNA ou inibição da apoptose de células de órgãos vitais. A alimentação pode

auxiliar na prevenção do dano, mas não quando este já está instalado (BERGER, 2004).

1.4.2.2 Teste de micronúcleos em células de mucosa bucal e com bloqueio de