Os derivados de 3-benzoil-flavanonas obtidas nesse trabalho foram avaliados quanto à atividade anti trypanosoma cruzi, frente às formas intracelulares do parasito. Os ensaios foram realizados no Centro de Pesquisa René Rachou (Fiocruz), localizado em Belo Horizonte, MG.
A metodologia utilizada para realização dos testes encontra-se em anexo IV.
Tabela 5- Resultado dos testes in vitro anti Trypanosoma cruzi.
Os resultados referentes à avaliação da atividade anti Trypanosoma cruzi de 29 Composto CI50 sobre o parasita1 (g/ mL) CI50 sobre as células2 (g/ mL) Índice de Seletividade3 (84) 8,8 80 9,1 (85) 10,74 441,90 40,3 (86) 21,95 231,14 10,5 (87) 5,8 223,40 38,5 (88) 183,90 243,10 1,3 (89) 7,60 92,13 12,1 (90) Inativo - - (91) 29,30 110,50 3,8 (92) Inativo - - (93) 22,49 111,10 4,9 (94) 24,99 107,48 4,3 (95) 63,02 62,48 1 (96) 223,40 223,40 1 (97) 37,35 103,05 2,8 (98) 212,70 - - (99) 26,52 408,10 15,4 (100) Inativo - - (101) 141,18 206,12 1,4 (102) 17,55 106,35 6,1 (103) 18,36 102,02 5,5 (104) 23,20 220,95 9,5 (105) 59,17 204,95 3,5 (106) Inativo - - (107) Inativo - - (108) Inativo - - (130) 113,80 503,0 4,4 (131) 2,6 27,54 10,60 (132) 13,2 449,26 34,03 (133) 8,3 38,56 4,6 BDZ 3,81 2.381 625 NFX 0,40 1,84 4,6
1 CI50: 50% de concentração inibitória. 2 CI50: concentração citotóxica
de 50% determinada utilizando células L929 de mamífero. 3 SI: índice
compostos produzidos neste trabalho estão apresentados na Figura 28. As seguintes informações podem ser encontradas nessa tabela: concentração inibitória (CI50) sobre o parasito; concentração inibitória (CI50) sobre células do
hospedeiro vertebrado e índice de seletividade (IS). O valor de CI50 sobre o
parasito indica a concentração do composto que reduz o crescimento parasitário em 50%; Os valores de CI50 sobre células do hospedeiro indicam a concentração
do composto que induz a morte de 50% dessas células. O índice de seletividade (IS) determina a ausência (ou não) de efeitos citotóxicos nas células do hospedeiro vertebrado.
Dos 29 compostos produzidos neste trabalho, todos foram submetidos a ensaios in vitro para avaliar a atividade anti trypanosoma cruzi e 23 compostos foram ativos, sendo o composto (131) com maior destaque apresentando atividade anti trypanosoma cruzi (CI50= 2,6 µM) superior ao fármaco de
referência BDZ (3,81 µM). Os compostos (84), (87), (89) e (133), também, apresentaram excelentes resultados com CI50= 8,8; 5,8; 7,60 e 8,3 µM
respectivamente.
Comparando com os resultados apresentados na Figura 28 com o composto (84), que é a 3-benzoil-flavanona sem substituinte, percebemos que ao introduzir grupos doadores de elétrons, como 4-OCH3 no composto (87) e 4-
OCH2Ph no composto (89) do anel fenílico C verifica-se uma atividade anti
Trypanosoma cruzi mais pronunciada e quando introduzimos grupos retiradores
de elétrons, tais como os halogênios flúor na posição para e cloro na posição
orto no composto ocorre uma redução da atividade anti Trypanosoma cruzi,
como podemos observar pelos valores de CI50= 10,74 e 21,95 µM
respectivamente.
Analisou-se, também, a introdução de grupos doadores e retiradores de elétrons apenas no anel fenílico B. Os grupos avaliados foram: 4-Cl (91), 4-CH3
(92), 4-OCH3 (96) e o grupo furanil (106), sendo que o composto (91) foi o mais
ativo com CI50= 29,30 µM, e o composto (96) foi o menos ativo com CI50= 223,40
µM. Os compostos (92) e (106) foram inativos.
A partir dos compostos substituídos com o grupo 4-CH3 no anel fenílico B,
analisou-se também uma segunda substituição no anel fenílico C utilizando os substituintes, 4-F, 2-Cl e 4-OCH3. Os compostos com substituição apenas do
4-F (93), 2-Cl (95) e 4-OCH3 (94) no anel fenílico C apresentaram atividade
significativa com CI50= 22,49; 63,02 e 24,99 µM respectivamente. Os compostos
com substituição do grupo 4-OCH3 apenas no anel fenílico C apresentou CI50=
223,40 µM e com a introdução dos grupos 4-OCH3 (97) 4-FPh (98) e 4-ClPh (99)
no anel fenílico C apresentaram uma melhor atividade com CI50= 37,35; 212,70
e 26,52 µM respectivamente.
A mesma análise foi feita para os compostos com o grupo furanil na posição 2, entretanto mesmo variando os grupos, 4-OCH3 (107) e 4-F (108), no
anel fenílico C continuaram sendo inativos.
Variando a introdução de grupos no anel fenílico A no qual foi introduzido apenas o grupo 5-OCH3 (100) vimos que ele foi inativo, mas ao analisarmos uma
segunda substituição no anel fenílico C com os grupos 4-OCH3 (101) 4-F (102)
e 4-Cl (104) passaram a ser ativos com CI50= 141,18; 17,55 e 18,36 µM. Já os
compostos com substituição do anel fenílico A com apenas o 5-Cl (104) apresentou CI50= 141,18 µM mas ao introduz o grupo OCH3 (101) no anel fenílico
6 ESTUDOS IN SILICO DOS PARÂMETROS FÍSICO-QUÍMICOS
O perfil da biodisponibilidade oral dos compostos foi avaliado pela aplicação da regra de Lipinski e avaliação dos dados relacionados ao risco de toxicidade (multagenicidaade, tumorogenicidade, irritabilidade e efeitos no sistema reprodutor) realizadas por meio de programas on-line “Molinspiration” (http://www.molinspiration.com/) e “OSIRIS property explorer” (http://www.organic-chemistry.org/prog/peo/ nos quais investigou a potencialidade teórica dos compostos (84-108 e 130-133) produzidos neste trabalho como possíveis candidatos a novos fármacos.
A regra de Lipinski, também conhecida como a Regra dos Cinco, foi assim caracterizada uma vez que os quatros parâmetros analisados são múltiplos de cinco e sua finalidade é predizer se o composto tem ou não características físico- químicas ideais a de um fármaco. Os parâmetros analisados são: 1- A existência de menos do que 5 doadores de ligação de hidrogênio (expresso pela soma de OH e NH na molécula); 2- A existência de menos do que 10 aceptores de ligação hidrogênio; (expresso pela soma de átomos de N e O); 3- O peso molecular não pode exceder 500 g.mol-1 = 500 Da; 4- O cLog P deve possuir um valor limite
igual a 5 (58) (59).
Os resultados expressos na Tabela 6, mostram que os compostos (84,
86-88, 90, 92, 96-98, 100-102, 106-108, 130 e 131) satisfazem a regra de Lipinski
sem nenhuma violação, ou seja, seriam fármacos com boa disponibilidade oral. Os demais compostos violam a regra por apresentarem lipofilicidade (Log P) maior que 5,0, o que poderia ocasionar problemas com a biodisponibilidade oral. Com a finalidade de melhorar as estimativas de toxicidade, foram criadas algumas extensões da regra de Lipinski, em que as moléculas candidatas a fármacos devem possuir log P na faixa de -0,4 a +5,6; número de átomos de 20 a 70; superfície polar inferior a 140 Â2 e menos que 10 ligações rotativas e de
acordo com esses novos critérios adotados todos os compostos (84-108 e 130-
133) passam a satisfazer a regra dos cinco (58) (60) (59).
Calculou-se através do programa OSIRIS os riscos de toxicidade teórica, que atenta para fragmentos que possam causar efeitos mutagênico, tumorigênico, irritante e sobre o sistema reprodutivo. O programa OSIRIS
classifica os riscos de toxicidade em alto risco (AR), médio risco (MR), baixo risco (BR) ou nenhum risco (NR). A avaliação da toxicidade dos compostos (84-108 e
130-133) revelou que apenas o composto (131) contendo o grupo nitro-furano,
Tabela 6- - Parâmetros da Regra dos cinco de Lipinski e Risco de toxicidade.
Parâmetros da Regra dos cinco de Lipinski Risco de toxicidade
Composto ALH DLH MM (g.mol-1) log P Violações TPSA
(A2) Volume A3 NLR M T I ER (84) 3 0 328,37 4,43 0 43,38 296,63 3 NR NR NR NR (85) 3 0 362,81 5,06 1 43,38 310,16 3 NR NR NR NR (86) 3 0 346,36 4,59 0 43,38 301,56 3 NR NR NR NR (87) 4 0 358,39 4,49 0 52,61 322,17 4 NR NR NR NR (88) 4 0 329,36 3,26 0 56,27 292,47 3 NR NR NR NR (89) 4 0 434,39 6,08 1 52,61 393,82 6 NR NR NR NR (90) 3 0 266,30 3,21 0 43,38 241,78 2 NR NR NR NR (91) 3 0 362,81 5,11 1 43,38 310,16 3 NR NR NR NR (92) 3 0 342,39 4,88 0 43,38 313,19 3 NR NR NR NR (93) 3 0 360,38 5,04 1 43,38 318,12 3 NR NR NR NR (94) 4 0 372,42 4,93 0 52,61 338,73 4 NR NR NR NR (95) 3 0 376,84 5,51 1 43,38 326,72 3 NR NR NR NR (96) 4 0 358,39 4,49 0 52,61 322,17 4 NR NR NR NR (97) 5 0 388,42 4,54 0 61,84 347,72 5 NR NR NR NR (98) 4 0 376,38 4,65 0 52,61 327,10 4 NR NR NR NR (99) 4 0 392,84 5,12 1 52,61 335,71 4 NR NR NR NR (100) 4 0 358,39 4,46 0 52,61 322,17 4 NR NR NR NR (101) 5 0 388,42 4,52 0 61,84 347,72 5 NR NR NR NR (102) 4 0 376,38 4,63 0 52,61 327,10 4 NR NR NR NR (103) 4 0 392,84 5,09 1 52,61 335,71 4 NR NR NR NR (104) 3 0 362,81 5,08 1 43,38 310,16 3 NR NR NR NR (105) 4 0 392,84 5,14 1 52,61 335,71 4 NR NR NR NR (106) 4 0 318,33 3,69 0 56,52 278,19 3 NR NR NR NR (107) 5 0 348,35 3,74 0 65,75 303,74 4 NR NR NR NR (108) 4 0 336,32 3,85 0 56,52 283,12 3 NR NR NR NR (130) 4 1 318,33 4,72 0 59,67 277,82 3 NR NR NR NR (131) 7 1 363,32 4,80 0 105,50 301,15 6 AR NR NR NR (132) 3 0 356,42 5,01 1 43,38 329,67 4 NR NR NR NR (133) 3 1 324,38 5,01 1 37,92 294,07 2 NR NR NR NR
ALH = aceptores de ligações de hidrogênio, DLH = doadores de ligações de hidrogênio, MM = massa molecular, TPSA = área e superfície polar topológica, logP = coeficiente de partição água/octanol. M=multagenicidade; T=Tumorogenicidade; I= irritação da pele; RE=efeito reprodutivo; NR = nenhum risco, BR = baixo risco, MR = médio risco, AR = alto risco.
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Esta pesquisa objetivou sintetizar uma variedade de moléculas derivadas de 3-benzoil-flavanonas bioativas por meio de metodologias adaptadas da literatura a fim de avaliar a atividade frente ao protozoário Trypanosoma cruzi. Para execução desta etapa foi sintetizado β-dicetonas como intermediários, para a síntese dos derivados de 3-benzoil-flavanonas. Além disso, procurou-se explorar possibilidades de reações no carbono α a carbonila da 3-benzoil- flavanona com intuito de avaliar a atividade anti Trypanosoma cruzi, caracterizando todos os produtos finais por métodos espectroscópicos de infravermelho (IV) espectrometria de massas de alta resolução e ressonância magnética nuclear (RMN 1H e 13C).
Foram obtidos 07 intermediários de β-dicetonas (77-83) com excelentes rendimentos variando de 71 a 91 %, 25 derivados de 3-benzoil-flavanonas (84-
108) com rendimentos satisfatórios em torno de 30 a 97%, sendo 16 derivados
inéditos. Obteve-se também dois compostos em equilíbrio tautômerico com os grupos furano e nitrofurano (130 e 131), um produto de alquilação no carbono α a carbonila (132), e um composto tricíclico (133). Todos os produtos finais foram caracterizados por IV e RMN de 1H e 13C.
Os resultados in silico mostraram que todos os 29 produtos finais (84-108,
130-133) satisfazem a extensão da regra de Lipinski, o que indica que estes
apresentam uma boa disponibilidade oral. As análises quanto ao risco de toxicidade, indica que todos os derivados com exceção de dois compostos possuem potencial para candidatos a fármacos. Todos os 29 produtos finais também foram submetidos a ensaios in vitro para avaliar a atividade anti Trypanosoma cruzi e 23 compostos foram ativos, sendo o composto (131) com maior destaque apresentando atividade anti Trypanosoma cruzi (CI50= 2,6 µM)
superior ao fármaco de referência BDZ (3,81 µM). Os compostos (84), (87), (89) e (133) também apresentaram excelentes resultados com CI50= 8,8; 5,8; 7,60 e
8,3 µM respectivamente.
De forma geral, os derivados sintetizados neste trabalho apresentaram rendimentos satisfatórios, e tanto os resultados in silico quanto os resultados da atividade anti Trypanosoma cruzi mostraram que essa classe de compostos
pioneiro de aplicação desses derivados de 3-benzoil-flavanonas em testes de atividade anti Trypanosoma cruzi os resultados obtidos foram muito relevantes, sendo que são ainda necessários estudos mais aprofundados em relação ao mecanismo de ação e testes in vivo.
8 METODOLOGIA
Pontos de fusão
Os pontos de fusão foram determinados em capilares de vidro num aparelho de fase aquecida Buchi B-540 (Departamento de Química, UFOP).
Espectroscopia de Infravermelho
Os espectros no infravermelho (IV) foram registrados em aparelho ABB Bomen MB 3000 (FTIR), região de alta frequência (4000 a 400 cm-1), com
resolução de 4 cm-1 e 32 varreduras por amostra. As amostras líquidas foram
realizadas por Refletância Total Atenuada (ATR), em cristal de ZnSe. As amostras sólidas foram prensadas em prensa hidráulica na forma de pastilha de KBr na proporção 100:2 KBr/amostra (Departamento de Química, UFOP).
Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear
Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear de hidrogênio e carbono foram registrados em espectrômetros Bruker Avance 400 MHz da Universidade Federal de Ouro Preto, UFOP. O solvente utilizado foi o clorofórmio deuterado (CDCl3). Os valores dos deslocamentos químicos (δ) são apresentados em ppm
relativamente ao padrão interno tetrametilsilano e os valores de acoplamento (J) são expressos em Hz. As multiplicidades estão abreviadas da seguinte forma: simpleto (s), dupleto (d), duplo dupleto (dd), tripleto (t), duplo tripleto (dt) e multipleto (m).
A numeração adotada para os átomos de todos os compostos não corresponde à numeração da nomenclatura IUPAC. Isso foi feito para que compostos com estruturas análogas pudessem ter os seus dados de RMN comparados, quando necessário.
Espectrometria de Massa de Alta Resolução
As análises foram realizadas no espectrômetro de massas LCMS-IT-TOF (Shimadzu) - Departamento de Química, UFOP. Foram injetados 5 µL de amostras, injeção direta, utilizando fase móvel água e acetonitrila com ácido fórmico 0,1 %, 50:50, com vazão de 0,2 mL/min. Foi utilizado modo SCAN positivo e negativo com faixa m/z de aquisição de ± 50.0000 em relação ao m/z
do íon precursor calculado, com tempo de acumulação de 100.00 msec. O software utilizado para cálculo do m/z teórico (função Accurate Mass Calculator) e para o tratamento dos resultados foi o LCMSSolution versão 3.60.361. (Departamento de Química, UFOP).
Cromatografia
Nas reações cuja evolução foi acompanhada por cromatografia em camada delgada (CCD) utilizaram-se placas de alumínio pré-revestidas de sílica gel 60 F254 da Merck. Como revelador, foi utilizado luz ultravioleta (UV) na faixa de comprimento de onda de 254 nm.
Os procedimentos de purificação foram por recristalização com solventes adequados, ou cromatografia em coluna utilizando sílica gel 60 (70-230 mesh, E. Merck).