TESTE DE CITOTOXICIDADE / METABOLISMO MITOCONDRIAL – MTT 33

As três maiores concentrações de AgNP e todas as concentrações de AuNP aumentaram (mais de 68%) a atividade metabólica mitocondrial em relação ao grupo não exposto (Figura 9).

A possibilidade de um resultado falso positivo provocado pela absorção de luz pelas NPs (verificada no teste de interferência das nanopartículas sobre o ensaio) foi excluída, uma vez em que, mesmo estas suprimindo a absorbância no comprimento de onda do teste (Figura 7C), as respostas celulares obtidas foram detectadas pelo significativo aumento da absorbância em relação ao controle.

Metabolismo Mitocondrial

Figura 9 – Metabolismo mitocondrial após 24h de exposição sob diferentes concentrações de AgNP e AuNP. Média ± erro padrão. Asterisco (*) indica diferença significativa em relação ao grupo controle (Ctrl). * p<0,05; **p<0,01; *** p<0,001.

Corroborando com estes dados, Ahlberg et al. (2014) incubaram queratinócitos humanos HaCat com AgNP durante 42h, e as células apresentaram aumento do metabolismo mitocondrial, nas concentrações de 10 and 20 µg.ml^-1.

AuNPs (50 mg.ml^-1) também foram capazes de aumentar a atividade metabólica de células A549 (linhagem de carcinoma pulmonar) após 24, 48 e 72h de exposição, porém este aumento foi apresentado apenas por AuNPs de 20 e 40 nm.

As AuNPs de 10 nm não apresentaram diferenças estatísticas relevantes, e as de 5 nm foram citotóxicas, mais uma vez mostrando que os efeitos de nanopartículas são dependentes do tamanho e tipo celular (LIU et al., 2014).

Sierra-Rivera et al. (2013) em estudos com AgNP (120nm) em células B16F10 detectaram através do teste de MTT efeitos citotóxicos concentração-dependentes, em concentrações de 7 µg.ml^-1 a 17.5 µg.ml^-1. As concentrações menores de 1,75 µg.ml^-1, 3,5 µg.ml^-1 e 5 µg.ml^-1 não foram citotóxicas, tampouco aumentaram o metabolismo mitocondrial, não apresentando diferenças estatísticas em relação ao controle. O fato das NPs apresentarem respostas celulares diferentes ao deste trabalho, mesmo trabalhando com a mesma linhagem, pode ser devido à grande diferença no tamanho e da concentração das nanopartículas utilizadas.

8.5 ATIVIDADE DOS TRANSPORTADORES DE EFLUXO

A exposição às NPs, tanto de Ag quanto Au, não causou efeitos estatisticamente significativos na atividade dos transportadores de efluxo de drogas/xenobióticos em qualquer um dos grupos. Embora as AgNP tenham

Figura 10 – Atividade dos transportadores de efluxo de drogas após 24h de exposição sob diferentes concentrações de AgNP e AuNP. Média ± erro padrão. Asterisco (*) indica diferença significativa em relação ao grupo controle (Ctrl). * p<0,05; **p<0,01; *** p<0,001.

Embora os presentes dados não tenham revelado algum efeito, muito têm se investigado sobre as nanopartículas sobre o sistema MDR. Trabalhos que investigaram a conjugação de quimioterápicos à AuNP, a fim de otimizar a captação destas drogas, em linhagens MDR - resistentes à multidrogas (linhagem de células MCF-7/ADR, de câncer de mama; WANG et al. (2011) e linhagem de hepatocarcinoma HepG2R; GU et al. (2012)), com resultados promissores. Os quimioterápicos associados às nanopartículas conseguiram superar o sistema MDR e foram capazes de aumentar a concentração intracelular da droga em relação à administração da droga livre (DREADEN et al., 2012).

Quanto às AgNPs, tradicionalmente têm sido reconhecidas pelo seu potencial microbicida (SWATHY et al., 2014; VAN PHU et al., 2014). Porém, estas nanopartículas também têm se mostrado eficientes no combate a bactérias que desenvolvem resistência a antibióticos. Não somente elas têm atividade microbicida intrínseca, como também atuam de forma sinérgica quando conjugadas a antibióticos, sendo capazes de subverter o sistema MDR, sendo mais eficazes do que o antibiótico ou a própria nanopartícula separados (BROWN et al., 2012).

Brown et al. (2012) investigaram a ação de AgNP e AuNPs. AuNPs não apresentaram propriedades microbicidas intrínsecas como as AgNPs, porém, quando funcionalizadas com ampicilina, ambas NPs apresentaram amplo espectro de ação, contra bactérias gram-negativas e gram-positivas.

8.6 PROLIFERAÇÃO CELULAR

Os grupos respectivos as duas concentrações mais altas de AgNP e as quatro mais altas de AuNP apresentaram taxas de 13 a 25% de redução na proliferação celular (Figura 11).

Proliferação celular AuNP. Média ± erro padrão. Asterisco (*) indica diferença significativa em relação ao grupo controle (Ctrl). * p<0,05; **p<0,01; *** p<0,001.

Nanopartículas de ouro também inibiram a proliferação de células endoteliais de veia umbilical humana e reduziu os níveis de fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) em cultura, apresentando efeito antiangiogênico (PAN et al., 2014).

De modo semelhante, AshaRani, Hande & Valiyaveettil (2009) em experimentos utilizando AgNPs sobre fibroblastos humanos (IMR-90) e células de glioblastoma humano (U251), observaram que a exposição resultou na inibição da proliferação celular, além de apresentarem anormalidades cromossômicas.

8.7 NANOPARTÍCULAS E O MELANOMA

Embora estes resultados revelem aumento da viabilidade celular e do metabolismo mitocondrial – o que em um primeiro momento nos leva a pensar que a exposição às NP esteja tornando estas células cancerosas mais resistentes e ativas, é visto que elas sofrem redução em sua taxa de proliferação.

Mais análises específicas são necessárias para compreender as respostas desta linhagem. Porém, a exposição das NPs às células B16F10 podem ter causado, a princípio, um estresse inicial que tenha aumentado a atividade mitocondrial e lisossomal. Entretanto este estresse prejudicou um dos parâmetros importantes na progressão do processo cancerígeno, que é a taxa de proliferação celular.

Se fosse possível extrapolar essa situação para um modelo in vivo, seria esperado que a exposição às nanopartículas reduzissem a taxa de progressão do tumor. Ainda que esta possibilidade contrarie as expectativas iniciais, estes resultados trazem novas perspectivas para estudos e aplicações de extrema importância destas nanopartículas na área biomédica.

9 CONCLUSÕES

Pela característica intrínseca das nanopartículas de absorverem luz, foi visto que elas podem ser detectadas pelos comprimentos de onda empregados nas presentes análises. Contudo, a magnitude das respostas celulares apresentadas sobrepôs possíveis ‘falsos positivos’.

A exposição das células B16F10 às AgNPs e AuNPs causou aumento na viabilidade celular e no metabolismo mitocondrial. Entretanto, a proliferação celular foi afetada, apresentando taxas menores em relação ao controle. A atividade dos transportadores de efluxo não foi alterada pela exposição.

Contudo, pelo fato das NPs alterarem esses parâmetros, o efeito das NPs como contaminantes ambientais ainda não pode ser excluído e mais trabalhos são necessários para maior esclarecimento destas respostas celulares.

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