Teste de dissolução

O método desenvolvido e validado para a avaliação da dissolução de comprimidos contendo 300 mg de fumarato de tenofovir desoproxila foi testado em equipamentos com diferentes métodos de coleta (manual e automático) para verificar a adequabilidade do método.

O teste foi realizado com comprimidos contendo 300 mg de fumarato de tenofovir desoproxila do lote 09080845 do produto candidato a similar/ genérico.

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3.4 Resultados e discussão

3.4.1 Seletividade

Foi realizada a varredura espectral das amostras do placebo puro e do diluente e não foram identificadas bandas de absorção em 260 nm. A amostra do placebo fortificado apresentou o mesmo perfil espectral do padrão de referência tenofovir da Nortec e do padrão de trabalho, indicando que os excipientes não interferem na seletividade do método, conforme demonstrado nas figuras 13 e 14.

Figura 13 – Espectros obtidos para o diluente e para o placebo puro.

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3.4.2 Linearidade

3.4.2.1 Testes de premissas

O teste de resíduos padronizados de Jacknife não identificou nenhum valor extremo, sendo mantidos todos os dados obtidos.

A premissa de que os resíduos da regressão devem seguir a distribuição normal foi confirmada pelo teste de Ryan-Joiner. O coeficiente de correlação obtido foi de 0,9759, superior ao valor crítico de 0,9506. Desta forma podemos concluir que o desvio da normalidade não é significativo (p > 0,10).

A homoscedasticidade foi confirmada pelo teste de Brown-Forsythe, com estatística tL (t de Levene) igual a 1,61 menor que t crítico de 2,160.

A independência dos resíduos da regressão foi confirmada pelo teste de Durbin-Watson, indicando que não existe correlação entre os resíduos.

3.4.2.2 Adequação ao modelo linear

A significância da regressão foi avaliada por análise de variância, onde o valor de F calculado, 77817,08, foi maior que o F crítico, 4,667, mostrando que a regressão é significativa.

O desvio de linearidade também foi avaliado por análise de variância, onde o valor de F calculado, 2,994, foi menor que o F crítico, 3,708, mostrando que não há desvio de linearidade.

O coeficiente de correlação linear, r2, foi de 0,99983.

A curva obtida para o fármaco na faixa de 0,01650 mg/mL a 0,04950 mg/mL, com a equação e coeficiente de correlação encontra-se na figura 15.

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Figura 15 – Curva obtida para o fármaco na faixa de 0,01650 mg/mL a 0,04950 mg/mL, com a equação e coeficiente de correlação.

3.4.3 Teste de efeito matriz

3.4.3.1 Testes de premissas

O teste de resíduos padronizados de Jacknife permitiu a identificação de dois (2) valores extremos (pontos 12 e 13, terceira replicata do nível de concentração a 125% e primeira replicata do nível de concentração a 150%), os quais foram excluídos do conjunto de dados.

A premissa de que os resíduos da regressão devem seguir a distribuição normal foi confirmada pelo teste de Ryan-Joiner. O coeficiente de correlação obtido foi de 0,9701, superior ao valor crítico de 0,9454. Desta forma podemos concluir que o desvio da normalidade não é significativo (p > 0,10).

A regressão linear pelo método dos mínimos quadrados ordinários assume que cada nível da faixa tem uma variação absoluta constante (homocedasticidade). A homoscedasticidade foi confirmada pelo teste de Brown-Forsythe, com tL (t de Levene) igual a 8,28E-01 menor que t crítico de 2,201.

A independência dos resíduos da regressão foi confirmada pelo teste de Durbin-Watson, indicando que não existe correlação entre os resíduos.

y = 21,55x + 0,009 R² = 0,999 0,000 0,500 1,000 1,500 0,000 0,010 0,020 0,030 0,040 0,050 0,060 R e s p o s ta ( a b s o rv â n c ia ) Concentração (mg/mL) Gráfico da Linearidade

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3.4.3.2 Adequação ao modelo linear

A significância da regressão foi avaliada por análise de variância, onde o valor de F calculado, 316695,19, foi maior que o F crítico, 4,84, mostrando que a regressão é significativa.

O desvio de linearidade também foi avaliado por análise de variância, onde o valor de F calculado, 0,515, foi menor que o F crítico, 4,066, mostrando que não há desvio de linearidade.

O coeficiente de correlação linear, r2, foi de 0,99997.

A curva matrizada obtida para o fármaco na faixa de 0,0165 mg/mL a 0,0495 mg/mL, com a equação e coeficiente de correlação encontra-se na figura 16.

Figura 16 – Curva matrizada obtida para o fármaco na faixa de 0,0165 mg/mL a 0,0495 mg/mL, com a equação e coeficiente de correlação.

3.4.3.3 Teste de homoscedasticidade das curvas usual e matrizada

O teste de F indicou heterogeneidade das variâncias dos resíduos das curvas usual e matrizada, com valor de F calculado igual a 4,99 maior que F crítico de 2,76, portanto, será utilizado teste t com variâncias distintas para avaliação do efeito de matriz. y = 21,6137x + 0,0114 R² = 0,99997 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40 0,000 0,010 0,020 0,030 0,040 0,050 0,060 R e s p o s ta ( a b s o rv â n c ia ) Concentração (mg/mL)

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3.4.3.4 Teste t para comparação de inclinações e interseções

Os valores de t´a e t´b calculados foram 0,5957 e 0,7055, ambos menores que t crítico de 2,1009, indicando que não existem diferenças significativas entre a inclinação e a interseção das curvas, concluindo que não existe efeito de matriz.

3.4.4 Exatidão, precisão e limites de detecção e quantificação

A estimativa das concentrações das amostras fortificadas foi determinada por meio da curva de calibração.

A recuperação foi calculada através da comparação das concentrações obtidas para as amostras fortificadas em relação à concentração teórica adicionada.

3.4.4.1 Exatidão

O teste de Grubbs (α=0,05) indicou a presença de dois valores extremos (replicatas 11 e 12) para o nível de concentração de 0,03300 mg/mL os quais foram excluídos do conjunto de dados. Não foram identificados valores extremos entre os resultados de recuperação para as amostras adicionadas nos níveis de concentração de 0,02475 mg/mL e 0,04125 mg/mL.

Os valores individuais de recuperação encontrados estão entre 98,57% e 101,70%, conforme tabela 21, e as médias de recuperação obtidas encontram-se entre 99,96% e 100,49%.

O método se mostrou exato para os níveis de concentração estudados.

3.4.4.2 Precisão

A repetibilidade (precisão intra-corrida) foi avaliada pela concordância entre os resultados obtidos dentro de um curto período de tempo com o mesmo analista e mesma instrumentação.

94 A precisão intermediária ou reprodutibilidade parcial (precisão inter-corridas) foi avaliada pela concordância entre os resultados do mesmo laboratório, mas obtido em dias diferentes, com analistas diferentes e equipamentos diferentes.

Os dados para cada nível de concentração estão apresentados nas tabelas 22, 23 e 24.

Tabela 21 – Dados de recuperação aparente para avaliação da exatidão. Nível de concentração 0,02475 mg/mL 0,03300 mg/mL 0,04125 mg/mL R e c u p e ra ç ã o a p a re n te ( % ) 99,221 98,883 98,569 99,407 99,385 98,791 99,777 99,439 99,014 100,020 99,717 99,681 100,207 99,806 99,904 100,334 100,086 100,013 100,704 100,273 100,461 100,954 100,412 100,685 101,075 100,506 100,685 101,141 101,107 100,797 101,328 101,206 * 101,021 101,701 101,766 * 101,349

* dados excluídos identificados como valores extremos pelo teste de Grubbs.

Tabela 22 – Dados obtidos nos 4 experimentos para o nível de concentração 0,02475 mg/mL.

Experimento Replicatas do ensaio Recuperação aparente

1 1 99,407 2 100,704 3 101,075 2 1 99,777 2 99,221 3 100,334 3 1 100,020 2 100,954 3 101,328 4 1 101,141 2 100,207 3 101,701

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Tabela 23 - Dados obtidos nos 4 experimentos para o nível de concentração 0,03300 mg/mL.

Experimento Replicatas do ensaio Recuperação aparente

1 1 100,273 2 100,412 3 101,107 2 1 99,439 2 98,883 3 99,717 3 1 100,086 2 101,206 * 3 100,506 4 1 99,385 2 99,806 3 101,766 *

* dados excluídos identificados como valores extremos pelo teste de Grubbs.

Tabela 24- Dados obtidos nos 4 experimentos para o nível de concentração 0,04125 mg/mL

Experimento Replicatas do ensaio Recuperação aparente

1 1 99,904 2 99,014 3 98,569 2 1 98,791 2 101,349 3 99,681 3 1 100,461 2 100,685 3 101,021 4 1 100,685 2 100,797 3 100,013

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3.4.4.3 Teste de premissas para ANOVA

A normalidade dos resíduos foi confirmada pelo teste de Ryan-Joiner com Req calculado de 0,9518, 0,9771 e 0,9777, maiores que Rcrítico de 0,9422, 0,9347 e 0,9422 (α= 0,05), respectivamente para os níveis de concentração de 0,02475 mg/mL, 0,03300 mg/mL e 0,04125 mg/mL.

A homoscedasticidade dos resíduos foi confirmada pelo teste de Brown- Forsythe, com Fcalculado de 0,077, 0,236 e 1,011, menores que Fcrítico de 4,066, 4,757 e 4,066 (α= 0,05).respectivamente para os níveis de concentração de 0,02475 mg/mL, 0,03300 mg/mL e 0,04125 mg/mL.

3.4.4.4 Teste de ANOVA para estimativa da precisão sob condições de repetitividade e reprodutibilidade parcial

Nos experimentos em condições de repetitividade e reprodutibilidade parcial, a precisão é avaliada por análise de variância. O DPRr calculado foi de 0,72%, 0,40% e 0,78%, respectivamente para os níveis de concentração de 0,02475 mg/mL, 0,03300 mg/mL e 0,04125 mg/mL, menores que o limite de 3,30%. O DPRR calculado foi de 0,80%, 0,69% e 0,94%, respectivamente para os níveis de concentração de 0,02475 mg/mL, 0,03300 mg/mL e 0,04125 mg/mL, menores que o limite estipulado de 5,00%.

De acordo com os resultados obtidos verificou-se que todas as premissas foram cumpridas e que os desvios calculados estão abaixo do limite, demonstrando a precisão do método em condições de repetitividade e reprodutibilidade parcial.

3.4.4.5 Limites de detecção (LD) e quantificação (LQ)

Os limites de detecção e quantificação do método foram definidos a partir do menor nível estudado nos testes de precisão e exatidão do método, sendo iguais a 0,024750 mg/mL.

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3.4.5 Robustez

Os resultados de recuperação média obtidos para cada grupo no ensaio de robustez estão demonstrados na tabela 25.

Tabela 25 – Resultados de recuperação média obtidos no ensaio de robustez.

Variável 1 2 3 4 5 6 7 8 A, a A A A A a a a a B, b B B b b B B b b C, c C c C c C c C c D, d D D d d d d D D E, e E e E e e E e E Resultado s t u v w x y z 99,46% 99,86% 104,67% 98,23% 100,27% 97,16% 101,94% 99,36%

O teste de Grubbs (α=0,05) não indicou a presença de valores extremos no ensaio da robustez. Os valores individuais de recuperação encontram-se entre 95,0% e 105,0% e a média de recuperação (100,12%) encontra-se entre 97,0% e 103,0%.

Para avaliação do efeito de cada variável, foi calculada a diferença entre as médias para os quatro resultados obtidos nas duas condições avaliadas, os resultados estão representados na tabela 26.

Tabela 26 – Efeito das variáveis analíticas no ensaio da robustez.

Variáveis Resultados X - x

Comprimento de onda de leitura

A 100,56

0,87

a 99,68

Tempo de agitação no orbital B 99,19 -1,86

b 101,05

Tempo de agitação no ultrassom C 101,58 2,93

c 98,65

Filtro de papel quantitativo D 100,16 0,07

d 100,08

Reagentes E 100,16 0,09

e 100,08

X – média dos valores obtidos na primeira condição avaliada (Ex: A) x – média dos valores obtidos na segunda condição avaliada (Ex: a)

98 De acordo com os resultados obtidos, as variáveis que apresentam maior influência sobre o método em questão foram o tempo de agitação no ultrassom, o tempo de agitação no agitador orbital e o comprimento de onda de leitura. É importante que estas variáveis sejam monitoradas com atenção na rotina de utilização do método analítico.

Em relação à recuperação, o método analítico apresentou-se robusto para todas as condições avaliadas, uma vez que a recuperação média encontrada para todos os grupos encontra-se entre 97% e 103%.

3.4.6 Estabilidade das soluções

A diferença entre as respostas obtidas para a mesma solução, quantificadas com intervalo de 24 horas, foi de 0,57%, 0,37% e 0,82%, respectivamente para as amostras da substância de referência Nortec, do padrão de trabalho de fumarato de tenofovir desoproxila e do placebo fortificado 100%.

Todas as diferenças encontradas foram inferiores a 2% e as amostras foram consideradas estáveis nas condições do método aplicado, o que já era esperado uma vez que o fármaco se demonstrou bastante estável em soluções de HCl a temperatura ambiente durante os estudos de estresse.

3.4.7 Teste de dissolução

Os resultados obtidos para o teste de dissolução do lote 09080845 do produto candidato a similar/ genérico encontram-se na tabela 27.

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Tabela 27 – Resultados obtidos para o teste de dissolução em equipamentos diferentes. CEDÊNCIA (%)

Cuba Dissolutor Vankel 7000 Coleta _Manual Dissolutor Varian 7025 Coleta _Automática

Cuba 1 99,68 % 99,33 % Cuba 2 98,73 % 97,06 % Cuba 3 97,10 % 98,26 % Cuba 4 95,75 % 97,99 % Cuba 5 97,38 % 96,52 % Cuba 6 98,19 % 96,93 % Média 97,81 % 97,68 %

Desvio padrão relativo (DPR) 1,40 % 1,07 %

Não houve diferença significativa entre as médias obtidas para os valores de cedência nos dois equipamentos, indicando que ambos podem ser utilizados para aplicação do método.

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4 MÉTODOS ANALÍTICOS APLICADOS NO CONTROLE DE QUALIDADE