Teste de especificidade do coquetel enzimático

Foi realizado um teste de hidrólise para averiguar se o coquetel enzimático produzido pelo fungo é específico ao substrato que o induz. Para tanto, o T. harzianum foi cultivado em reator contendo meio suplementado com BHD ou Celufloc. Após 72 horas de cultivo, o sobrenadante foi coletado e o extrato enzimático foi avaliado quanto aos níveis de atividade sobre diversos substratos padrões. Em seguida, foram montadas reações de hidrólise contendo os extratos mencionados e BHD ou Celufloc como substrato-alvo. O volume de extrato adicionado em cada reação foi nivelado de modo a se obter 5 FPU por grama de substrato. Por conseguinte, foram calculados os níveis das demais atividades presentes em cada reação, os quais foram apresentados na Figura 6.

Figura 6 – Níveis de atividade enzimática em cada reação do ensaio de especificidade, ao se

utilizar extrato enzimático induzido com BHD (eBHD) ou Celufloc (eCEL).

Legenda: Os níveis de atividade foram expressos em UI por grama de substrato a ser hidrolisado (BHD ou Celufloc), sendo que os valores reais devem ser calculados multiplicando-se a atividade (UI/g) sobre o substrato: CMC* (carboximetilcelulose) por 10; pNPG* (p-nitrofenil-β-D-glucopiranosídeo) por 10; β-glucano* por 100; xilana* por 100; wAXY* (arabinoxilano de trigo) por 10; liquenano* por 10. pNPC: p-nitrofenil-β-D- celobiosídeo.

O nivelamento baseado na atividade de FPase fez com que as amostras contendo o extrato induzido com BHD (eBHD) tivessem uma carga enzimática maior, com 17,3% a mais de proteína total. Em teoria, a adição do eBHD proporcionou uma atividade

0 2 4 6 8 10 12 C ar ga e n z im áti c a (U I / g d e s u b str ato )

Substrato sobre o qual se mediu a ativiade enzimática

eBHD eCEL

sobre pNPC (de celobiohidrolase) 58,2% maior, comparando com o eCEL. Da mesma maneira, 56,1% maior sobre CMC (endoglucanase), 73,9% sobre pNPG (β-glucosidase), 26,0% sobre β-glucano, 36,0% sobre arabinoxilano e 55,7% maior sobre liquenano. A única atividade, dentre as avaliadas, em que a adição do extrato induzido com Celufloc sobressaiu- se foi a de xilanase, com uma diferença de 6,8% a mais dessa medida.

Após a adição dos extratos enzimáticos, as reações de hidrólise foram incubadas por até 48 horas, sendo então determinadas (por HPLC) as concentrações de glicose, celobiose e xilose liberadas a partir do substrato. Baseando-se nisso, foi calculada a conversão de polissacarídeos (celulose e hemicelulose) em açúcares simples (glicose, celobiose e xilose) para cada condição, como apresentado na Figura 7.

Figura 7 – Conversão de celulose e hemicelulose em açúcares simples (glicose, celobiose e

xilose) após hidrólise realizada com extrato enzimático produzido a partir de cultivo com bagaço (eBHD) ou Celufloc (eCEL), empregando-se, como substrato da reação, 5% (m/v) de bagaço ou Celufloc, durante 24 a 48 horas de incubação.

0 24 48 0 10 20 30 40 50 Hidrólise de Celufloc eBHD eCEL C o n v er sã o d e c el u lo se e h em ic el u lo se ( % ) tempo de hidrólise (h) Hidrólise de BHD 0 24 48 eBHD eCEL tempo de hidrólise (h) 0 10 20 30 40 50

Legenda: As barras de erro referem-se aos desvios padrões de reações em duplicata. Quando necessário, foram realizados os devidos descontos da quantidade de açúcar presente no extrato enzimático e liberado pelo substrato da hidrólise (controles).

A análise da Figura 7 permite algumas considerações. Por exemplo, o substrato BHD foi mais recalcitrante que a Celufloc, o que pode ser verificado de duas formas. Independente do extrato adicionado, a conversão do BHD foi menor que a da Celufloc, cujo rendimento foi de até 45,3%, enquanto que o rendimento máximo da hidrólise do BHD foi de até 21,8%. Além disso, a decomposição do bagaço estagnou-se em 24 horas, ao passo que a da Celufloc continuou até 48 horas, respectivamente, o menor e o maior períodos de incubação avaliados. Isso pode estar relacionado com a composição e estrutura do material.

Segundo Kumar et al. (2018), os processos termoquímicos, aos quais a biomassa vegetal é submetida durante a etapa de pré-tratamento, contribuem para que a interação entre a celulose e o complexo lignina-hemicelulose, que a recobre, torne-se mais reforçada. Dessa forma, a estrutura fica mais recalcitrante e mais difícil de ser decomposta. Para a obtenção de ambos substratos, houve o emprego de altas temperaturas no pré- tratamento, principalmente no caso do bagaço.

Ao se verificar a composição dos substratos (Tabela 1), observa-se que os teores de celulose foram muito próximos entre si. A Celufloc apresentou 86,01% de celulose, enquanto que o BHD, 85,80%. Além disso, os índices de cristalinidade foram parecidos entre eles (Figura 2). Dessa forma, a celulose parece não ser um parâmetro adequado para distinguir esses substratos. O BHD apresentou um teor de 8,04% de lignina e 1,61% de hemicelulose. Por sua vez, a Celufloc possuiu 0,97% de lignina e 14,91% de hemicelulose. Assim, a maior quantidade de lignina residual parece ter contribuído de forma mais significativa para a recalcitrância do bagaço.

De acordo com Yang et al. (2011), todos os constituintes da parede celular vegetal são de alguma forma modificados pelos pré-tratamentos, dependendo das tecnologias e condições aplicadas, o que dificulta deduzir se a alteração de microfibrilas de celulose, a remoção de hemiceluloses, a modificação ou realocação da lignina ou ainda outros efeitos sobre o substrato são os responsáveis por aumentar a eficiência enzimática. A remoção da hemicelulose aumenta a digestão enzimática da celulose, já que aquela constitui uma barreira sobre esta. Além disso, vale ressaltar que as cadeias de hemicelulose são extensivamente acetiladas em muitos tipos de biomassa e que a deacetilação pode até triplicar a digestibilidade da hemicelulose (YANG et al., 2011). Entretanto, outros estudos apontam que a redução da cristalinidade e a remoção da lignina são mais importantes que a remoção de grupos acetilas (CHANG; HOLTZAPPLE, 2000).

A lignina dificulta a acessibilidade à celulose e também diminui a atividade de celulases, visto que ela adsorve proteínas da fase aquosa (YANG et al., 2011). Mediante o exposto, o fato de o rendimento da hidrólise do BHD ter sido menor que o da Celufloc pode dever-se ao maior teor de lignina no BHD.

Como verificado nesse ensaio de hidrólise, a Celufloc foi mais acessível, independente do extrato enzimático, permitindo uma maior liberação de açúcares redutores, comparado ao BHD. A hidrólise da Celufloc aumentou no intervalo entre 24 e 48 horas de incubação, enquanto que a de BHD estagnou em 24 horas. Assim, pode-se presumir que, quando se realiza o cultivo do fungo, a Celufloc é um substrato mais acessível e que fornece moléculas indutoras (como a celobiose) por mais tempo que o BHD. Isto remete ao fato de que a indução dos genes de enzimas ocorre por um tempo maior no cultivo com Celufloc, em relação ao cultivo com BHD. Vide ensaios com Celufloc e BHD após 36 horas (Figura 4).

Outra observação pertinente sobre os dados da Figura 7 consiste no fato de que o extrato hidrolisou mais o respectivo substrato no qual o fungo fora cultivado. Isso também foi verificado por Brink et al. (2014), que cultivaram duas cepas de Aspergillus niger e duas de Trichoderma reesei em bagaço de cana ou palha de trigo e utilizaram os extratos obtidos em ensaios de sacarificação dos mesmos substratos. Eles verificaram que o complexo enzimático produzido foi adaptado para a sacarificação do substrato disponível, em todas as cepas.

Quando se considera a hidrólise do BHD, é possível que a melhor performance do eBHD deva-se à sua maior carga enzimática, como mencionado anteriormente. Não se descarta, porém, a possibilidade de que outras enzimas ou proteínas acessórias tenham sido induzidas especialmente durante o cultivo com BHD. Ao se observar a hidrólise da Celufloc, é bem nítido o melhor desempenho do eCEL, apesar da sua menor carga enzimática, em termos de proteína total, no ensaio. Como mencionado, a única atividade, dentre as avaliadas, que o eCEL proporcionou maior nível em relação ao eBHD foi a de xilanase. Além disso, ao se voltar para os dados de expressão gênica (Figura 4), averigua-se que a expressão da CE5 (acetil xilano esterase) foi 4,2 vezes maior (após 48 horas de cultivo) em Celufloc, comparado a BHD. A atividade dessa enzima remove os grupos acetilas ao longo da cadeia do xilano, facilitando o acesso de outras enzimas que degradam a hemicelulose e, por conseguinte, das que atacam a celulose também.

A especificidade observada dos extratos também pode ser discutida em relação à hemicelulose. Embora não se tenham dados mais completos da composição dos substratos (teor de arabinose, ácido glucurônico), algumas considerações podem ser feitas sobre os

materiais de origem. A Celufloc é produzida a partir do eucalipto, cujo principal tipo de xilano é o glucuronoxilano, em cujas ramificações está ligado o ácido D-glucurônico em grandes quantidades (HEROLD et al., 2013). Já a hemicelulose do bagaço tem como representante o glucuronoarabinoxilano, o qual possui substituições laterais de unidades de arabinose e de ácido 4-O-metil-glucurônico ao longo da cadeia de xilose (CARVALHO et al. 2017). Considerando a biomassa como um todo, o bagaço de cana (in natura) possui 1,8 vez mais xilose e 6,5 vezes mais arabinose, comparado a eucalipto. Este, por sua vez, possui 3,2 vezes mais de ácidos urônicos e 1,6 vez a mais de galactose que o bagaço (CARVALHO et al. 2015). Todavia, é importante ressaltar que os processos termoquímicos empregados na produção da Celufloc e do BHD podem ter alterado essas proporções dos substituintes. Relembrando também que a Celufloc apresentou maior teor de hemicelulose (Tabela 1), podendo os seus componentes servirem de indutores para a expressão das enzimas hidrolíticas. Observando-se os dados de determinação de açúcares por HPLC liberados no ensaio de hidrólise (especificidade), verificou-se uma liberação de até 0,72 mM de arabinose a partir da Celufloc, enquanto que, na sacarificação do BHD, não houve detecção. Essa concentração de arabinose, embora baixa, pode ter contribuído para a indução de alguma enzima diferenciada.

Em T. reesei, sabe-se que a xilose é indutora de genes de xilanase. Herold et al. (2013) demonstraram que a arabinose também induz a expressão de xilanase, de uma maneira dependente do XYR1, além de arabinofuranosidase e β-xilosidase. Além disso, o T. reesei possui genes de α-metil-glucuronidases e glucuronil-xilanases. Tais enzimas, caso sejam expressas em T. harzianum também, podem ter um impacto significativo na conversão dos substratos estudados.

Outras enzimas não avaliadas certamente contribuíram para a especificidade dos extratos a seu substrato indutor. A fim de se verificar o perfil de proteínas dos extratos enzimáticos em questão, os mesmos foram avaliados por SDS-PAGE (Figura 8), padronizando-se as amostras por proteína total.

Figura 8 – Perfil de proteínas dos extratos enzimáticos induzidos com BHD (eBHD) ou com

Celufloc (eCEL).

Legenda: (MM) marcador de massa molecular; (1) e (2) 0,9 µg de proteína total do eBHD e do eCEL, respectivamente, aplicado em cada poço do gel; (3) e (4) 3 µg de proteína total do eBHD e eCEL, respectivamente, aplicado em cada poço. Ao lado esquerdo da figura, encontram-se as massas moleculares em kDa do marcador. Os valores '53,2', '22,7' e '18,2' são as massas estimadas em kDa para algumas bandas.

Analisando-se a Figura 8, é possível verificar que ambos os extratos apresentaram um perfil parecido, mas com algumas particularidades. No eCEL, há uma banda de 53,2 kDa (valor estimado) bem nítida, a qual tem uma intensidade muito menor no eBHD. Além disso, existe uma banda de 18,2 kDa (valor estimado) mais forte no eCEL do que no eBHD. Vale ressaltar que a identificação de proteínas apenas visualizando as bandas do gel não é precisa, pois cada banda pode ser um conjunto de vários tipos de proteínas. Outrossim, a glicosilação das proteínas nem sempre é constante, o que pode gerar diferentes estimativas entre os trabalhos. E, como os padrões utilizados foram pré-corados, o tamanho dos padrões também não é preciso. Entretanto, algumas observações podem ser feitas.

Benoliel, Torres e Moraes (2013) analisaram o extrato enzimático do T. harzianum cultivado com bagaço de cana por SDS-PAGE e fizeram um zimograma. Eles observaram atividade de celulase (sobre CMC) nas bandas de aproximadamente 50 e 20 kDa. Eles supuseram que a banda de 20 kDa pode corresponder à endoglucanase III, descrita por Generoso et al. (2012), a qual não possui o CBM (módulo de ligação à celulose). Além disso, foi detectada atividade de xilanase nas bandas de 20 kDa e em outras de aproximadamente 75 kDa.

A banda de 18,2 kDa poderia ser atribuída à xilanase, uma vez que esta apresentou uma atividade mais diferenciada, comparando o eCEL com o eBHD. Futuros trabalhos, empregando espectrometria de massas, poderão avaliar esses dois extratos de uma forma mais minuciosa e, assim, ajudar a elucidar qual enzima ou proteína acessória contribuiu para a especificidade de cada complexo enzimático.

5 CAPÍTULO 2 - ESTRATÉGIA DE MELHORAMENTO GENÉTICO

Em fungos produtores de celulases, existem mecanismos de indução e repressão que agem em sincronia para regular a síntese dessas enzimas, mediante a disponibilidade de substrato. Tal regulação é essencial para a sobrevivência do microrganismo, pois permite a manutenção do seu equilíbrio energético. Contudo, isso consiste em uma barreira para a produção de enzimas a nível industrial. Dessa forma, diversas estratégias são elaboradas para superar essa questão, como, por exemplo, a manipulação de fatores de transcrição.

No entanto, modificações isoladas dificilmente atingem o objetivo de se obter linhagens mutantes capazes de produzir elevados níveis de enzimas celulolíticas. Diante disso, Yao et al. (2015) usaram três estratégias simultâneas de manipulação genética no fungo Penicillium oxalicum. Eles deletaram o gene creA, que codifica para o repressor de amplo espectro CreA, e o gene de uma β-glucosidase, uma vez que sua atividade de hidrólise diminui a concentração de um substrato indutor (celobiose), enquanto aumenta a de um repressor (glicose). Além disso, eles fizeram a superexpressão do regulador positivo clrB. Assim, eles tentaram bloquear algumas vias de repressão e elevar o nível da indução. Com isso, observaram, no sobrenadante da cultura do mutante, um aumento de 10 vezes na concentração de proteína total (secretada) e de 20 vezes na atividade de FPase. Porém, a transformação de fungos filamentosos é uma etapa desafiadora, o que torna inevitável que ela seja feita passo a passo.

Com relação ao objeto de estudo, o T. harzianum, foram realizadas algumas modificações genéticas, no intuito de aumentar a produção de enzimas que decompõem a biomassa vegetal. Delabona et al. (2017) conseguiram a superexpressão do xyr1, um dos principais reguladores positivos, e observaram um aumento de 66% na atividade de FPase. Tamietti et al. (2017) fizeram a deleção do cre1, o que permitiu um aumento de 2 vezes na atividade de endoglucanase (sobre CMC) e de 2,7 vezes na de xilanase. Em T. reesei, a deleção do cre1 provoca retardo no crescimento e alterações na morfologia da célula (NAKARI-SETÄLÄ, 2009). Por isso, no presente trabalho, foi dada prioridade para a manipulação da β-glucosidase de T. harzianum como um passo inicial.

A β-glucosidase converte a celobiose em glicose, mas também é capaz de produzir, por atividade de transglicosilação, celooligômeros, os quais podem induzir a expressão de genes celulolíticos. Shida et al (2015) observaram que a cepa T. reesei PC-3-7,

um mutante superprodutor de celulase, possui uma mutação pontual no gene de β-glucosidase cel1a, o que acarretou na substituição de uma aminoácido (V409F). Os autores estudaram essa substituição e verificaram que a enzima modificada apresentou uma atividade muito reduzida de hidrólise da celobiose, porém foi capaz de produzir alguns produtos de transglicosilação.

Mediante o exposto, neste capítulo está apresentada a estratégia de melhoramento genético elaborada para reproduzir essa mutação no gene cel1a de T. harzianum P49P11.