Teste de fertilidade - MATERIAL E MÉTODOS

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1.2. Metodologia

4.2.2.5. Teste de fertilidade

Para a realização do teste de fertilidade foram utilizadas 13 éguas. Cada uma delas foi submetida à inseminação artificial por três ciclos, totalizando 39 ciclos. Cada égua foi inseminada com espermatozóides provenientes dos grupos: ejaculado (EJ-0h), recuperados do epidídimo imediatamente após orquiectomia (EP-0h) e recuperados do epidídimo após 24 horas de armazenamento a 5°C (EP-24h).

17_{Leica Microsystems – DMLB-Alemanha}

As éguas foram distribuídas aleatoriamente e utilizadas nos três grupos testados (EJ-0h, EP-0h, EP-24h). Estas foram monitoradas por exame ultra-sonográfico transretal e, depois da constatação de um folículo com 35 mm, a ovulação foi induzida com 1 mg de GnRH (deslorelina). Após 34 horas da administração do indutor de ovulação, as mesmas foram monitoradas por ultrassonografia até a detecção da ovulação. Neste momento, as fêmeas foram inseminadas com 800x106 espermatozóides móveis pré congelação, obtidos através de um “pool” formado por uma palheta de cada garanhão, que formaram um total de oito palhetas.

As oito palhetas foram descongeladas a 46ºC por 20 segundos, acondicionadas dentro da pipeta flexível18 e, com auxílio de um mandril, os espermatozóides foram depositados na extremidade do corno ipsilateral à ovulação.

O diagnóstico de gestação foi realizado entre 12 e 15 dias após a ovulação, com o auxílio do ultra-som (Pie Medical Falcon 100 Vet)19.

18_{Minitub do Brasil Ltda, Porto Alegre-RS, Brasil} 19_{Nutricel, Ltda.}

5. ANÁLISE ESTATÍSTICA

Para a análise estatística do experimento I, os resultados provenientes dos grupos Controle, 5°C-06h, 5°C-12h, 5°C-18h, 5°C-24h, 5°C-30h, TA-6h, TA-12h, TA- 18h, TA-24h e TA-30h, foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de TUKEY.

Para análise estatística do experimento II, os parâmetros espermáticos dos espermatozóides provenientes do ejaculado, dos espermatozóides do epidídimo recuperados, imediatamente, após a orquiectomia ou espermatozóides recuperados do epidídimo após 24 horas de armazenamento a 5°C, foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de TUKEY. Para os resultados de fertilidade entre os grupos (EJ-0h), (EP-0h) e (EP-24h) foi empregado o Teste Exato de Fisher.

O nível de significância em todas as análises foi considerado significativo quando p<0,05.

6. RESULTADOS 6.1 Experimento I

No experimento I, o número médio de espermatozóides recuperados da cauda do epidídimo pela técnica de fluxo retrogrado foi de 16,2±7,79 x 109 de espermatozóides/epidídimo.

A partir dos resultados obtidos no experimento I, foram calculadas as médias e desvios padrão dos parâmetros dos espermatozóides da cauda do epidídimo imediatamente após recuperação (tabela 1), após ressuspensão com o diluente de congelação (tabela 2) e pós-descongelação (tabela 3).

Tabela 1 – Valores médios e desvios padrão de motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP), velocidade linear progressiva (VSL), velocidade curvilínea (VCL), espermatozóides rápidos (RAP) e integridade de membrana plasmática (IMP) imediatamente após a recuperação espermática nos grupos: controle (0 hora), armazenados à 5°C (5°C-06h, 5°C-12h, 5°C-18h, 5°C-24h e 5°C-30h) e armazenados à temperatura ambiente (TA-6h, TA-12h, TA-18h, TA-24h e TA-30).

Grupos (n=8) MT (%) MP (%) VSL (µm/s) VCL (µm/s) RAP (%) IMP (%) Controle 29.4±20.80a 9,8_±7,90ab 68,2_±8,83ab 205,0_±20,10ab 20,1_±17,31ab 72,1_±10,28a 5°C-06h 44,±21,98a _17,6_±12,11a _70,6_±9,46a _175,9_±21,16a _32,88_±18.12a_69,9_±17,33ab 5°C-12h 30,0±30,61ab 10,1_±12,41ab 75,4_±11,44ab 181,0_±34,78a 21,88_±28.70ab 68,1_±9,28ab 5°C-18h 32,9±20,61ab 11,7_±10,48ab 71,5_±6,82ab 171.1_±18,30a 22,5_±18,10ab 62,0_±9,30ab 5°C-24h 26,4±18,73ab 8,6_±10,50ab 59,3_±13,81aab 162,6_±34,62abc 7,1_±8,66b 66,0_±10,66ab 5°C-30h 36,5±26,95a 13,0_±10,58ab 77,8_±13,12a 185,3_±29,88a 26,25_±19,41a 68,8_±14,62ab TA-06h 32,88±26,95ab _12,5_±9.69ab _64,4_±6,95ab _156,5_±28,52abc _22.9_±18.54ab _69,4_±12,23ab TA-12h 1,1±1,25b 0,25_±0,46b 31,6_±27,98b 86,8_±72,97 abc 0,25_±0,46b 65,3_±13,48ab TA-18h 0,6±1,06b 0,25_±0,46b 18,4_±25,6.46b 39,5_±54,52 abc 0,1_±0,35b 62,0_±14,32ab TA-24h 1,7±3,11b 0,25_±0,71b 38,8_±36,02b 90.8_±81,00bc 3,5_±5,29b 48,5_±20,06b TA-30h 1,0±0,76b 0,5_±0,53b 30.0_±36,48b 66,3_±72,19c 0,2_±0,46b 50,9_±19,77ab

Letras diferentes na mesma coluna diferem significativamente (p<0,05). TA (armazenamento à temperatura ambiente), h (hora), 5°C (armazenamento à 5 graus Celsius).

Tabela 2 – Valores médios e desvios padrão de motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP), velocidade linear progressiva (VSL), velocidade curvilínea (VCL), espermatozóides rápidos (RAP) e integridade de membrana plasmática (IMP) após a centrifugação e a ressuspensão com diluente Botu-Crio®_nos grupos: controle (0 hora), armazenados à 5°C (5°C-06h, 5°C-12h, 5°C-18h, 5°C-24h e 5°C-30h) e armazenados à temperatura ambiente (TA-6h, TA-12h, TA-18h, TA-24h e TA-30).

Grupos (n=8) MT (%) MP (%) VSL (µm/s) VCL (µm/s) RAP (%) Controle 84,0±5,96a 46,4_±6,86a 83,0_±5,40a 184,0_±15,62ab 73,9_±8,40a 5°C-06h 77,4±11,29a 33,1_±8,92ab 80,5_±8,83a 201,5_±27,80a 66,2_±16,43a 5°C-12h 76,6±7,72a 31,4_±3,70ab 77,4_±6,99ab 197,0_±22,96a 63,6_±8,89a 5°C-18h 71,4±14,00a 27,6_±9,24bc 75,4_±8,58ab 198,4_±22,46a 60,1_±17,16a 5°C-24h 68,4±18,73a _27,4_±13,72bc _71,4_±11,13abcd _181,1_±24,96abc _53,4_±24,24a 5°C-30h 70,4±21,86a 29,6_±13,11b 76,9_±9,17ab 194,9_±21,43a 60,0_±23,84a

TA-06h 69,5±16,88a 27,6_±9,71bc 74,3_±9,25abc 170,4_±50,02abc 54,7_±20,51a

TA-12h 39,9±17,54b 13,0_±7,11cd 64,4_±4,34bcde 161,9_±19,39 abc 23,9_±12,64b

TA-18h 24,9±22,76bc 6,9_±7,43d 60,0_±6,46de 160,8_±17,77 abc 15,8_±18,60b

TA-24h 29,8±24,42bc _8,5_±8,00d _61,9_±7,20cde _150,2_±23,31bc _18,6_±20,27b

TA-30h 4,3±2,66c 0,9_±0,83d 56,4_±6,70e 141,9_±19,95c 1,9_±1,25b

Letras diferentes na mesma coluna diferem significativamente (p<0,05). TA (armazenamento à temperatura ambiente), h (hora), 5°C (armazenamento à 5 graus Celsius).

Tabela 3 – Valores médios e desvio padrão de motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP), velocidade linear progressiva (VSL), velocidade curvilínea (VCL), espermatozóides rápidos (RAP) e integridade de membrana (IMP) após a descongelação, nos grupos: controle (0 hora), armazenados à 5°C (5°C-06h, 5°C-12h, 5°C-18h, 5°C-24h e 5°C-30h) e armazenados à temperatura ambiente (TA-6h, TA-12h, TA-18h, TA-24h e TA- 30).

Grupos

(n=8) MT (%) MP (%) VSL (µm/s) VCL (µm/s) RAP (%) IMP (%) Controle 72,4±6,86a 36,2_±8,44a 78,7_±7,2a 178,7_±13,92a 59,2_±10,69a 41,4_±5,94a

5°C-06h 56,9±13,57ab 24,9_±10,11ab 74,6_±10,28ab 173,9_±24,49ab 42,1_±15,72ab 46,6_±9,94a

5°C-12h 51,4±11,84abc 24,0_±9,65abc 73,5_±8,29ab 175,2_±11,71ab 38,5_±13,40abc 40,8_±4,59a

5°C-18h 40,1±20,78abcd _17,6_±11,48bcde _65,9_±11,59abcd _159,3_±26,10ab _28,1_±17,75bcde _45,3_±12,44a

5°C-24h 52,8±21,86ab 21,0_±13,11bc 68,0_±12,61abc 162,2_±32,70ab 36,5_±23,26abc 45,0_±12,42a

5°C-30h 45,8±23,80abc 18,7_±9,68bcd 69,7_±11,96abc 169,4_±29,66ab 34,8_±21,10bc 40,4_±8,86a

TA-06h 49,0±13,65abc 19,6_±6,65bc 70,6_±6,62abc 166,2_±26,06 ab 33,6_±13,43bcd 43,5_±7,95a

TA-12h 25,4±15,60cde 10,0_±6,97cdef 63,5_±8,16bc 155.1_±24,69 ab 16,7_±12,80cdef 40,1_±3,87a

TA-18h 12,4±16,59e _3,6

±5,58 ef 51,9_±9,41d _145,8_±19,24 ab _7,4_±11,86ef _44,8_±10,14a

TA-24h 18,7±15,43de _4,8_±5,17de _61,8_±7,79bc _144,3_±22,55 ab _9,5_±11,19def _39,6_±9,72a

TA-30h 2,25±2,19e 0,4_±0,51f 54,8_±5,44c 139,7_±22,47b 0,9_±1,13f 29,9_±13,17a

Letras diferentes na mesma coluna diferem significativamente (P<0,05). TA (Armazenamento à temperatura Ambiente), h (Hora), 5°C (armazenamento à 5 graus Celsius).

Não houve diferença na MT tanto pré-congelação quanto pós-descongelação entre o grupo controle (0 hora) e os grupos armazenados a 5°C (5°C-06h, 5°C-12h, 5°C-18h, 5°C-24h e 5°C-30h). Entretanto, foi observada queda significativa da MT nos grupos armazenados a temperatura ambiente a partir de 12 horas de armazenamento (TA-12h, TA-18h, TA-24h e TA-30h) (Figura 6).

FIGURA 6 – Avaliação da porcentagem de espermatozóides móveis (Motilidade Total), recuperados do epidídimo pré-congelação (após a ressuspensão com diluente de congelação; A) e pós-descongelação (B) nos grupos: controle (0 hora), armazenados a temperatura ambiente e a 5°C por 6, 12, 18, 24 e 30 horas antes da recuperação espermática. *diferem significativamente do grupo controle p<0,05.

Não houve diferença na MP tanto pré-congelação quanto pós-descongelação entre o grupo controle (0 hora) e os grupos armazenados a 5°C por até 12 horas (5°C- 06h e 5°C-12h). A partir de 18 horas de armazenamento a 5°C (5°C-18h, 5°C-24h e 5°C-30h) e também em todos os grupos armazenados a temperatura ambiente (TA- 06h, TA-12h, TA-18h, TA-24h e TA-30h) houve queda significativa deste parâmetro espermático (Figura 7). A queda mais expressiva ocorreu a partir de 18 horas de armazenamento a temperatura ambiente, que obteve espermatozóides com MP <8,5% na análise pré-congelação (Tabela 2) e <4,8% na análise pós-descongelação (Tabela 3). A B * * * * * * * *

FIGURA 7 – Avaliação da porcentagem de espermatozóides com motilidade progressiva (MP), recuperados do epidídimo pré-congelação (após a ressuspensão com diluente de congelação; A) e após descongelação (B) nos grupos: controle (0 hora), armazenados a temperatura ambiente e a 5°C por 6, 12, 18, 24 e 30 horas antes da recuperação espermática. *diferem significativamente do grupo controle p<0,05.

Não houve diferença na VSL tanto pré-congelação quanto pós-descongelação entre o grupo controle (0 hora) e os grupos armazenados a 5°C (5°C-06h, 5°C-12h, 5°C-18h, 5°C-24h e 5°C-30h). Entretanto, foi observada queda significativa da VSL nos grupos armazenados a temperatura ambiente a partir de 12 horas de armazenamento (TA-12h, TA-18h, TA-24h e TA-30h) (Figura 8).

FIGURA 8 – Avaliação da Velocidade Linear Progressiva (VSL), dos espermatozóides recuperados do epidídimo pré-congelação (após a ressuspensão com diluente de congelação; A) e após descongelação (B) nos grupos: controle (0 hora), armazenados a temperatura ambiente e a 5°C por 6, 12, 18, 24 e 30 horas antes da recuperação espermática. *diferem significativamente do grupo controle p<0,05.

A B A B * * * * * * * * * * _* * * _* * * * _* _* * * _* * *

Como demonstrado na Figura 9, foi observada queda da VCL pré-congelação quando o epidídimo foi armazenado a temperatura ambiente por mais de 24 horas. Já no período pós-descongelação, a queda do mesmo só foi observada no grupo armazenado a temperatura ambiente por 30 horas quando comparado com o grupo cuja colheita de espermatozóides do epidídimo foi realizada imediatamente após a orquiectomia (controle, 0 hora).

FIGURA 9 – Avaliação da Velocidade Curvilínea (VCL), dos espermatozóides recuperados do epidídimo pré-congelação (após a ressuspensão com diluente de congelação; A) e após descongelação (B) nos grupos: controle (0 hora), armazenados a temperatura ambiente e a 5°C por 6, 12, 18, 24 e 30 horas antes da recuperação espermática. * diferem significativamente do grupo controle p<0,05.

Na análise realizada pré-congelação o número de espermátozóides rápidos apresentou queda significativa apenas nos grupos em que os epidídimos foram armazenados por 12 horas ou mais a temperatura ambiente (5°C-12h, 5°C-18h, 5°C- 24h e 5°C-30h) conforme descrito na tabela 2. Na avaliação pós-descongelação, houve queda da porcentagem de espermatozóides rápidos nos grupos armazenados a 5°C por 18 e 30 horas (TA-18h e TA-30h) e em todos os grupos armazenados a temperatura ambiente quando comparado com o grupo controle (Tabela 3; Figura 10).

A B

FIGURA 10 – Avaliação da porcentagem de espermatozóides rápidos (RAP), recuperados do epidídimo (após a ressuspensão com diluente de congelação; A) e após descongelação (B) nos grupos: controle (0 hora), armazenados a temperatura ambiente e a 5°C por 6, 12, 18, 24 e 30 horas antes da recuperação espermática. *diferem significativamente do grupo controle p<0,05.

Na análise pré-congelação da integridade de membrana plasmática não houve diferença entre o grupo controle (0 hora) e todos os grupos armazenados a 5°C (5°C- 06h, 5°C-12h, 5°C-18h, 5°C-24h e 5°C-30h). Foi observado apenas uma inferioridade deste parâmetro no grupo armazenado por 24 horas a temperatura ambiente (TA-24h) (tabela 2). Na avaliação pós-descongelação não foi observada nenhuma diferença entre os grupos (tabela 3 e Figura 11).

FIGURA 11 – Avaliação da porcentagem de espermatozóides com integridade de membrana plasmática (IMP), recuperados do epidídimo (após a ressuspensão com diluente de congelação; A) e após descongelação (B) nos grupos: controle (0 hora), armazenados a temperatura ambiente e a 5°C por 6, 12, 18, 24 e 30 horas antes da recuperação espermática. *diferem significativamente do grupo controle p<0,05. B A A B * * * * * * * * * * *

6.2 Experimento II

O número médio de espermatozóides colhidos com vagina artificial (EJ-0h) foi de 7,8±4,69 x 109. Nos epidídimos direitos este valor foi de 11,0±8,29 x 109 e de 14,0±8,99 x 109 nos epidídimos esquerdos (Figura 12).

O número de espermatozóides colhidos dos ejaculados foi significativamente inferior aos recuperados da cauda dos epidídimos (Epidídimos Direitos + Epidídimos Esquerdos) 25,0±17.13a x 109 (p<0,05).

FIGURA 12 – Média do número de espermatozóides recuperados com vagina artificial (Ejaculado), dos epidídimos direitos (Epidídimos D), dos epidídimos esquerdos (Epidídimos E) e soma dos epidídimos direito e esquerdo (Epidídimos D + E).

A partir dos dados obtidos nos três grupos, foram calculadas as médias e desvios padrão da motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP), velocidade linear progressiva (VSL), velocidade curvilínea (VCL), espermatozóides rápidos (RAP), Defeitos morfológicos (DEF) e integridade de membrana plasmática (IMP) dos espermatozóides do ejaculado (EJ-0h), espermatozóides recuperados do epidídimo, imediatamente após castração (EP-0h) e espermatozóides recuperados do epidídimo após armazenamento a 5oC por 24 horas (EP-24h). As análises foram realizadas em três

momentos: logo após a recuperação (tabela 4), após centrifugação e ressuspensão com o diluente de congelação (tabela 5) e pós-descongelação (tabela 6).

Tabela 4 - Valores médios e desvios padrão de motilidade total (MT), motilidade progressiva

(MP), velocidade linear progressiva (VSL), velocidade curvilínea (VCL), espermatozóides rápidos (RAP) e espermatozóides com defeitos morfológicos (DEF) logo após a recuperação nos grupos EJ-0h, EP-0h e EP-24h.

Grupos

(n=8) MT (%) MP (%) VSL (µm/s) VCL (µm/s) RAP (%) DEF (%)

EJ-0h 79,6±8,53a 43,3_±8,32a 99,6_±23,63a 183,4_±23,63ab 70,1_±11,03a 15,2_±4,38 a

EP-0h 29,4±15,58b _9,8_±7,90b _68,2_±8,83b _205,0_±20,11a _20,1_±10,56b _11,4_±4,56a

EP-24h 23,2±21,56b 6,7_±7,45b 62,1_±11,58b 159,8_±24,71b _14,9_±16,08b 10,8_±_3,15a

Letras diferentes na mesma coluna diferem significativamente (P<0,05). EJ-0h (Espermatozóides do ejaculado coletados por vagina artificial), EP-0h (Espermatozóides recuperados do epidídimo imediatamente após a orquiectomia), EP-24h (Espermatozóides recuperados do epidídimo 24 horas armazenados à 5o_C).

Tabela 5 - Valores médios e desvios padrão de motilidade total (MT), motilidade progressiva

(MP), velocidade linear progressiva (VSL), velocidade curvilínea (VCL), espermatozóides rápidos (RAP) e integridade de membrana plasmática (IMP) após a centrifugação e a ressuspensão com diluente de congelação (Botu-Crio®_{) nos grupos EJ-0h, EP-0h e EP-24h.} Grupos

(n=8) MT (%) MP (%) VSL (µm/s) VCL (µm/s) RAP (%) IMP (%)

EJ-0h 77,1±8,35a 42,8_±8,41a 88,2_±6,46a 183,7_±20,03a 68,9_±12,04a 51,8_±18,12b

EP-0h 84,0±5,50a 46,4_±6,86a 83,0_±5,41ab 184,0_±15,62a 73,9_±8,40a 72,1_±10,28a

EP-24h 83,1±7,5a 38,3_±7,14a 80,9_±6,03b 195,9_±14,47a 71,7_±9,85a 67,9_±13,77ab

Tabela 6 – Valores médios e desvios padrão de motilidade total (MT), motilidade progressiva

(MP), velocidade linear progressiva (VSL), velocidade curvilínea (VCL), espermatozóides rápidos (RAP) e integridade de membrana plasmática (IMP) após a descongelação nos grupos EJ-0h, EP-0h e EP-24h.

Grupos

(n=8) MT (%) MP (%) VSL (µm/s) VCL (µm/s) RAP (%) IMP (%)

EJ-0h 63,4±16,31a _33,0_±10,68a _76,3_±5,59 a _172,4_±14,18 a _53,9_±17,74a _35,9_±6,11b

EP-0h 72,4±6,86a _36,2_±8,44a _78,7_±7,23 a _178,7_±13,92 a _59,2_±10,69a _41,4_±5,94ab

EP-24h 62,9±10,64a 32,4_±9,34a 76,2_±4,84 a 164,8_±10,86 a 48,8_±12,03a 48,2_±7,03a

FIGURA 13 – Média do percentual da motilidade total (A), motilidade progressiva (B) e espermatozóides rápidos (C): obtidos do epidídimo logo após a recuperação, após a centrifugação e pós-descongelação nos grupos EJ-0h, EP-0h e EP-24h.

De acordo com os dados apresentados na Figura 13 foi observado aumento significativo (p<0,01) dos valores médios de motilidade total (A), motilidade progressiva (B) e espermatozóides rápidos (C) após centrifugação em relação às amostras analisadas logo após a recuperação espermática.

As taxas de concepção foram de 61.5% (8/13), 92.3% (12/13) e 61.5% (8/13), nos grupos EJ-0h, EP-0h e EP-24h, respectivamente (Figura 14). Os resultados de fertilidade expressos na Figura 10 indicaram que os espermatozóides recuperados dos epidídimos imediatamente após a orquiectomia tenderam (0,05>p<0,1) a uma maior taxa de concepção quando comparados aos dos grupos EJ-0h e EP-24h.

7. DISCUSSÃO

O diluente Botu-Crio® foi utilizado para congelação das amostras espermáticas em todos os grupos nos experimento I e II. Tal escolha baseou-se em estudos realizados com espermatozóides provenientes da cauda do epidídimo que obtiveram melhores resultados com o Botu-Crio® quando comparados aos resultados obtidos com os diluentes EDTA-Lactose e INRA-82 na congelação espermática (MELO et al., 2008; PAPA et al., 2008).

Para o armazenamento dos epidídimos nos grupos que utilizaram refrigeração (5°C-06h, 5°C-12h, 5°C-18h, 5°C-24h e 5°C-30h; Experimento I e EP-24; Experimento II), esta foi realizada com o auxílio do equipamento Botutainer®. Esta escolha deveu-se ao fato de ser um sistema seguro e eficiente na manutenção de sêmen equino a temperatura de 5°C (AVANZI et al., 2006; FARRÁS et al., 2008). A temperatura de 5°C foi mais eficiente na preservação espermática quando comparada a temperatura ambiente, resultado este demonstrado no experimento I e em outros estudos (JAMES et al., 2002; MURADÁS et al., 2006). Além disso, a escolha por este sistema de transporte passivo teve como objetivo facilitar a utilização do protocolo a campo, visto que muitos haras já possuem este equipamento comumente utilizado para transporte de sêmen refrigerado.

A técnica de fluxo retrógrado relatada por Garde et al., (1994) e Bruemmer et al. (2002) foi rápida e eficiente na recuperação de espermatozóides da cauda do epidídimo na espécie equina. O número total de espermatozóides colhidos foi similar ao relatado por Bruemmer et al. (2002) e significativamente superior ao número total de espermatozóides colhidos com vagina artificial (EJ-0h), conforme descrito na figura 12.

7.1 Experimento I

Em muitos casos a distância entre os Haras e laboratórios especializados torna-se uma dificuldade na preservação de espermatozóides do epidídimo. Desta forma, torna- se necessária a avaliação da viabilidade espermática em diferentes temperaturas de armazenamento, permitindo, assim, um transporte mais eficiente deste material.

Com a avaliação dos espermatozóides dos epidídimos armazenados a temperatura ambiente, pode-se estimar quanto tempo os espermatozóides permanecem viáveis em casos de morte súbita dos animais, situação na qual os testículos permanecem a temperatura ambiente até a colheita de espermatozóides do epidídimo.

Alguns trabalhos em equinos relatam o efeito do tempo de armazenamento do epidídimo sobre a viabilidade espermática (JAMES, 2004; GRANEMAN, 2006), mas nenhum comparou epidídimos armazenados a 5°C e a temperatura ambiente, com epidídimos processados imediatamente após orquiectomia justificando o desenvolvimento do experimento I. Além disso, este estudo avaliou a viabilidade espermática após processo de congelação com objetivo de manter células espermáticas viáveis após colheita para uso futuro.

Quando foi realizada a análise comparativa dos parâmetros espermáticos das células recuperadas imediatamente após a orquiectomia, nos grupos mantidos a 5°C foi observada similaridade dos parâmetros de MT, VSL, RAP e IMP até o período de 30 horas de armazenamento. Estes resultados estão em conformidade com os reportados por James (2004), que observou valores semelhantes nos epidídimos armazenados na mesma temperatura por até 96 horas.

A motilidade progressiva foi o parâmetro espermático mais sensível ao armazenamento do epidídimo, apresentando uma diminuição significativa após 12 horas a 5°C e 6 horas a temperatura ambiente, tanto na análise pré quanto pós-congelação. Em

bovinos este parâmetro foi correlacionado positivamente com a fertilidade pós descongelação (KJAESTAD et al., 1993). Entretanto, a capacidade fecundante não possui correlação absoluta com a motilidade espermática (CARVALHO e PAPA, 2003), sendo necessários estudos para avaliar a fertilidade destas células.

De acordo com os dados apresentados na tabela 2, não foi observada diferença significativa na MT e RAP entre os espermatozóides do grupo controle (0 hora) e os espermatozóides recuperados após armazenamento do epidídimo por período de até 12 horas a temperatura ambiente. Os dados obtidos apresentam-se semelhantes aos de Granemann (2006), o qual relatou queda significativa da motilidade e vigor apenas com períodos de armazenamento superiores à 12 horas. Entretanto, no estudo de Granemann (2006) a comparação foi realizada com os espermatozóides do ejaculado, e não com os espermatozóides do epidídimo recuperados imediatamente após a orquiectomia.

Nas análises de integridade de membrana plasmática, avaliada por microscopia de epi-fluorescência (ZÚCCARI, 1998), não foram observadas diferenças significativas na IMP entre os 11 grupos estudados pós-descongelação, indicando que tal parâmetro não sofreu influência do armazenamento do epidídimo até 30 horas, independente da temperatura. Isto corrobora com resultados similares obtidos em estudo realizado por James (2004).

No presente estudo, o armazenamento dos epidídimos a 5°C em sistemas de transporte passivo contribuiu para a diminuição do metabolismo espermático, proporcionando melhor preservação espermática durante o acondicionamento por até 30 horas, observando-se apenas diminuição da motilidade progressiva nos grupos com armazenamento superior a 12 horas. Já os espermatozóides armazenados a temperatura ambiente apresentaram queda significativa e gradativa dos parâmetros MT, MP, VSL e RAP tanto pré como pós congelação a partir de 12 horas de armazenamento.

7.2 Experimento II

No experimento II, a escolha do tempo de 24 horas de armazenamento do grupo 3 (EP-24h) foi fundamentada no experimento I e em trabalhos que não demonstraram diferenças nos parâmetros espermáticos após 24 horas de refrigeração a 5°C (JAMES et al., 2002; BRUEMMER et al., 2002; MURADÁS et al., 2006). Entretanto, nenhum destes estudos comparou a fertilidade dos espermatozóides após a refrigeração do epidídimo. Outro fator relevante na escolha do período de 24 horas de armazenamento foi que este período seria suficiente para o envio do material a laboratórios especializados na colheita e na congelação dos espermatozóides.

Como demonstrado na Tabela 4, a MT, MP, VSL e RAP dos espermatozóides do ejaculado (EJ-0h) foram superiores às encontradas nos espermatozóides recuperados do epidídimo (EP-0h e EP-24h). Esta diferença pode ser explicada pela ausência das secreções das glândulas acessórias, que além da função de transporte, também melhora a motilidade inicial após a ejaculação. Esta hipótese é sustentada pelo trabalho realizado por Tiplady et al, (2002), no qual os espermatozóides colhidos da cauda do epidídimo apresentaram uma melhora dos parâmetros espermáticos 15 minutos após a adição de plasma seminal.

Entretanto, a interferência do plasma seminal sobre a preservação espermática não é a mesma entre os garanhões, podendo ter efeito positivo (HEISE et al., 2010) ou negativo (MONTEIRO et al., 2009b). Essa diferença de resultados pode ser entendida pela grande variabilidade na composição bioquímica deste fluido entre os garanhões (AURICH et al., 1996; ZAHN et al., 2006).

Apesar da inferioridade inicial dos parâmetros espermáticos das células recém- colhidas do epidídimo, após a adição do diluente de congelação (Botu-Crio®) houve melhora significativa dos mesmos (Figura 13), chegando a equiparar-se aos resultados

obtidos com espermatozóides colhidos com vagina artificial. Estes resultados são semelhantes aos relatados por Tiplady et al. (2002); Granemann, (2006), Muradás et al., (2006). A melhora dos parâmetros espermáticos pode ser explicada pela ação de componentes do Botu-Crio®, capazes de estimular a ativação espermática (GRANEMANN, 2006). Esta função de ativação é exercida pelo plasma seminal em condições fisiológicas durante a ejaculação, como relatado por Tiplady et al. (2002).

A IMP foi superior no EP-0h antes da congelação e no EP-24h após a descongelação, quando comparada aos espermatozóides do ejaculado (Tabela 4). Essas evidências apóiam a hipótese de que os espermatozóides do epidídimo são menos sensíveis ao choque frio e, conseqüentemente, mais resistentes ao processo de congelação (JOHNSON et al, 1980).

A Tabela 4 demonstra que não houve diferença significativa na morfologia espermática entre os grupos estudados no experimento II. Estes achados diferem dos obtidos por estudos realizados em bovinos, que detectaram maior freqüência de defeitos morfológicos em amostras do epidídimo quando comparadas ao sêmen do ejaculado (SILVA et al., 2003, MARTINS et al., 2007).

Os resultados obtidos no grupo EP-24h demonstram que a refrigeração dos epidídimos por 24 horas antes da recuperação espermática foi eficiente na manutenção da viabilidade espermática, não sendo observadas diferenças dos parâmetros avaliados quando comparados ao grupo EP-0h. Estes resultados corroboram com achados laboratoriais encontrados em pesquisas anteriores (JAMES et al., 2002; BRUEMMER et al., 2002; BRUEMMER et al., 2006; MURADÁS et al., 2006).

Em relação às variáveis VSL e VCL, que expressam a velocidade espermática ao longo de sua trajetória, não houve diferença entre os espermatozóides recuperados do epidídimo imediatamente após a orquiectomia (EP-0h), com os colhidos com vagina

artificial (EJ-0h), demonstrando que ambos possuem as mesmas características de movimento. Esses resultados diferiram dos obtidos em estudos com a espécie bovina, que apresentou melhor movimento espermático dos espermatozóides provenientes do ejaculado, quando comparado aos do epidídimo (GOOVAERTS et al., 2006).

Os resultados de fertilidade encontrados no experimento II demonstram que os espermatozóides do epidídimo (EP-0h e EP-24h) apresentaram a mesma capacidade fecundante a do ejaculado (EJ-0h) (p>0,05). Estes resultados contrastam com os obtidos por Heise et al, (2010), os quais obtiveram menor taxa de concepção com o uso dos espermatozóides recuperados do epidídimo, sem exposição ao plasma seminal, quando comparados com sêmen ejaculado. As diferenças entre a metodologia de processamento dos epidídimos, o diluente de congelação utilizado e o protocolo de inseminação artificial podem ter contribuído para obtenção de diferentes resultados.

As taxas de concepção dos espermatozóides do epidídimo obtidos no presente estudo foram maiores do que as obtidas por estudos anteriores com espermatozóides a fresco (MORRIS et al., 2002; HEISE et al., 2010) ou congelado (BARKER e GANDIER, 1957; MORRIS et al., 2002; HEISE et al., 2010), e semelhantes as observados por Papa et al. (2008). A similaridade entre os resultados do experimento II com os descritos por Papa et al. (2008) pode ser em parte explicada pela utilização dos mesmos diluentes, além do mesmo método de inseminação na extremidade do corno uterino.

A aplicação de 10 mL cloridrato de lidocaína intratesticulares não resultou em variação dos parâmetros espermáticos nos grupos EP-0h e EP-24h, quando comparado ao grupo EJ-0h, contrariando a hipótese de Morris et al. (2002), na qual os autores relataram que a baixa fertilidade obtida através de inseminação utilizando

espermatozóides epididimários poderia ser devido a anestesia local que precede a orquiectomia.

8. CONCLUSÕES

Com base nos resultados obtidos nos experimentos I e II conclui-se que:

• A técnica de fluxo retrógrado foi rápida e eficiente na recuperação de espermatozóides da cauda do epidídimo, apresentando número de espermatozóides superior ao obtido no ejaculado.

• O armazenamento dos epidídimos a 5°C em sistemas de transporte passivo (Botutainer®) proporcionou melhor preservação espermática quando comparado

No documento Criopreservação e fertilidade de espermatozóides recuperados da cauda do epidídimo de garanhões (páginas 41-81)