Teste do micronúcleo com bloqueio de citocinese (TMNBC)

5.2.3.1 Identificação de sequências de DNA viral em sangue periférico

Coleta das amostras de sangue periférico: Foram coletados 5 mL de sangue periférico de cinco bezerros assintomáticos (Bos taurus, Simental). A opção por bezerros reduz eventuais resultados falso-positivos da correlação positiva entre idade e danos no DNA (HEUSER et al., 2008) e do status endrócrino e imune, verificados no período de transição6_{, que resulta em clastogênese (THARWAT;}

ENDOH; OIKAWA, 2012). O sangue foi coletado por meio de venopunção da veia jugular, empregando tubos a vácuo contendo heparina potássica (análise mutagênica) e EDTA (identificação de sequências virais).

Transporte do material biológico: O sangue coletado foi transportado para o Laboratório de Genética do Instituto Butantan em caixas térmicas, evitando assim eventuais danos no material genético que pudessem induzir resultados falso- positivos. O transporte em caixas térmicas permitiu, também, a preservação da viabilidade celular, necessária para garantir o sucesso das culturas destinadas ao teste do micronúcleo com bloqueio de citocinese (TMNBC).

Extração do DNA genômico e viral: O material destinado à identificação de sequências de BPV foi conservado a -20 ºC. O DNA foi extraído empregando o QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Alemanha), conforme descrito na seção 5.1.1.3.

Identificação e tipagem viral: A não identificação de sequências de BPV nas amostras de sangue periférico é fundamental para garantir a fidedignidade dos resultados obtidos nos testes mutagênicos. Isto porque estudos apontam que a presença de sequências virais está associada a danos na cromatina hospedeira (ARALDI et al., 2013a; MELO et al., 2011; STOCCO DOS SANTOS et al., 1998). Desta forma, as amostras de DNA fora submetidas à identificação de sequências virais por meio de PCR, empregando os pares de primers específicos para BPV-1, 2 e 4 (tabela 7) e degenerados Delta-Epsilon e Xi (tabela 10).

Tabela 10 - Sequência dos primers empregados na identificação do BPV

Primer Sequência (5’-3’) Gene alvo Amplicon

Delta-Epsilon CCAGAYTAYYTMAAAATGGC ATAAMKGCTAGCTTATATTC L1 430 pb Xi TWYAATAGDCCVTTTTGGAT TTMCGCCTACGCTTTGGCGC L1 600 pb

Nucleotídeos degenerados: Y (C ou T), M (C ou A), K (T ou G), W (A ou T), D (C, G ou T) e V (A, C ou G).

Parâmetros da PCR: As reações empregando os pares de primer degenerados Delta-Epsilon e Xi foram submetidas aos seguintes ciclos: 10 minutos a 94 ºC (denaturação inicial), 45 ciclos de um minuto a 94 ºC (denaturação), um minuto a 52 ºC (anelamento), um minuto a 72 ºC (extensão) e 10 minutos a 72 ºC (extensão final). A eletroforese foi realizada conforme descrito na seção 5.1.1.3.

5.2.3.2 Teste do micronúcleo em sangue periférico

As amostras de sangue periférico foram divididas em três grupos: (1) controle negativo, (2) controle positivo e (3) experimental. Cada grupo foi incubado em tubos de centrífuga de fundo cônico de 15 mL contendo: 4,5 mL de meio RPMI 1640 (Cultilab, Campinas, Brasil), suplementado com 0,5 mL de soro fetal bovino (SFB) (Cultilab, Campinas, Brasil) e 0,1 mL de fitohemaglutinina A (PHA) (Cultilab, Campinas, Brasil) e 200 µL de sangue total. A incubação de sangue total é preferencialmente recomendada, uma vez que o isolamento de células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) pode induzir danos no DNA decorrentes das etapas de centrifugação (COLLINS, 2004). O material foi incubado em estufa de cultura Orion modelo 502A (Fanen, São Paulo, Brasil) a 37 ºC por oito horas. Após este período, um volume de 1,25 µL da solução de ciclofosfamida monoidratada (Sigma-Aldrich, Alemanha) (figura 24A), na concentração de 50 µg/mL, diluída em PBS estéril foi adicionado ao grupo controle positivo. O grupo experimental foi incubado com 10,0 µL da oncoproteína recombinante E6 do BPV-1, na concentração final de 1 µg/mL. Esta concentração foi baseada em estudos prévios envolvendo a vacinação terapêutica contra a papilomatose bovina (CHANDRACHUD et al., 1994). Após 44 horas de início do procedimento, as culturas foram tratadas com 6 µL de citocalasina B (Sigma-Aldrich, Alemanha) (figura 24B), diluída em dimetilsulfóxido (DMSO), na concentração de 6 µg/mL.

Figura 24 - Fórmula estrutural da ciclofosfamida e da citocalasina B

A) Ciclofosfamida; B) citocalasina B. Fonte: Sigma-Aldrich.

A citocalasina B é um metabólito isolado do fungo Drechslera dematioidea, que impede a polimerização da actina (MAC-LEAN-FLETCHER; POLLARD, 1980). Esta ação impede a citocinese, originando linfócitos binucleados sem causar danos no material genético (DEGEN et al., 1997). A concentração de citocalasina B foi escolhida com base em Kirsch-Volders et al. (2003), onde é recomendada a adição de 6 µg/mL da droga para culturas de sangue total e 3 µg/mL para PBMCs. As culturas foram incubadas por 72 horas, pois tempos superiores de incubação podem induzir danos genéticos (MCKELVEY-MARTIN et al., 1993). Um modelo esquemático dos tempos de cultivo celular é mostrado na figura 25.

Figura 25 - Modelo esquemático da cultura de linfócitos

Modelo esquemático mostrando o tempo de aplicação do tratamento com a proteína E6 (grupo experimental) e ciclofosfamida e a adição da citocalasina B.

Após 72 horas, as culturas foram interrompidas com a adição de 0,5 mL do fixador Carnoy (3:1 metanol-ácido acético) por cinco minutos em temperatura ambiente. Os tubos foram centrifugados por 10 minutos a 300 g em centrifuga Mikro 22R (Hettich, Berlim, Alemanha). O sobrenadante foi descartado por inversão. Este procedimento foi realizado por três vezes.

Após a última centrifugação, o material foi aspirado e transferido para lâminas previamente limpas com álcool 70º. As lâminas foram secas em temperatura ambiente, fixadas em metanol absoluto (Merck, Alemanha) e coradas com solução de 2% de Giemsa (Merck, Alemanha) em tampão PBS pH 6,8 por oito minutos. O material foi lavado três vezes em água destilada por três minutos. As lâminas foram montadas com Entelan (Merck, Alemanha) e analisadas em microscópio binocular Axiophot (Carl Zeiss, Alemanha) com aumento total de 1.000 X. As imagens foram capturadas empregando o software AxioVision versão 4.7 (Carl Zeiss, Alemanha).

Análise estatística: Um total de 1.000 células foi analisado por lâmina, observando-se a frequência de linfócitos mono, bi, tri e polinucleados. Foi, também, analisado o número de linfócitos com micronúcleos (MNs) e pontes anafásicas (PA). Com base na frequência de linfócitos binucleados com micronúcleo, foram realizados os testes do Qui-quadrado (χ2_{) e Kruskal-Wallis, seguido do teste post-hoc}

de Dunn. Os testes foram realizados através do software BioEstat (AYRES et al., 2007), com nível de significância de 5%. O teste do Qui-quadrado permitiu avaliar diferenças estatísticas significativas dentro dos respectivos grupos. Já o teste de Kruskal-Wallis permitiu analisar as diferenças estatísticas entres os diferentes grupos.

Com base na frequência de linfócitos binucleados com MNs, foi calculada a frequência de formação de micronúcleos (MNr0), de acordo com a seguinte fórmula:

MNr0 = a/b

onde: a (número de linfócitos binucleados com MN) e b (número total de linfócitos binucleados).

Foi, também, calculado o índice de proliferação de bloqueio de citocinese (IPBC), que permite avaliar a toxicidade celular. O IPBC foi calculado de acordo com a fórmula:

IPBC = (1 x N1)x (2 x N2) x (3 x Nn)/1.000

onde: N1 (número de células mononucleadas), N2 (número de células polinucleadas)

5.2.3.3 Teste do micronúcleo em células epiteliais

Considerando o cárater epiteliotrópico do BPV, o potencial genotóxico da oncoproteína foi adicionalmente avaliado em células CRIB (células epiteliais de rim bovino não infectado pelo BPV). As células foram expandidas em placas de seis poços, contendo uma lamínula estéril/poço, com 2,0 mL de meio DMEM completo. Após obter uma confluência de 60%, as células foram tratadas com 50 µg/mL de ciclofosfamida (controle positivo) e1 µg/mL da oncoproteína recombinante E6 do BPV-1. Como controle negativo foram empregadas células CRIB sem a adição de nenhuma droga. Após uma hora, foi adicionado 6 µg/mL de citocalasina B. As células foram incubadas por 24 horas a 37 ºC. Após este tempo, o meio foi removido com auxílio de pipeta Pasteur e as células foram lavadas com PBS estéril a 4 ºC. O material foi fixado por uma hora com solução de formaldeído a 4%. As células foram lavadas por cinco minutos com PBS, sendo realizadas três lavagens e, então coradas com Giemsa puro (Merck, Alemanha) por um minuto. A lamínula foi transferida para lâminas de microscopia e analisadas em microscópio binocular Axiophot (Carl Zeiss, Alemanha) com aumento total de 1.000 X. As imagens foram capturadas empregando o software AxioVision versão 4.7 (Carl Zeiss, Alemanha).

Análise estatística: Um total de 1.000 células foi analisado por lâmina, observando-se a frequência de linfócitos mono, bi, tri e polinucleados. Foi, também, analisado o número de linfócitos com micronúcleos (MNs) e pontes anafásicas (PA). Os resultados foram apresentados na forma de histograma.

5.2.3.4 Ensaio cometa

As amostras de sangue foram fracionadas em três alíquotas de 200 μL cada. As alíquotas foram distribuídas em tubos de polipropileno de 1,5 mL contendo 200 μL de meio RPMI 1640, compondo os grupos: (1) controle negativo (não incubado com nenhuma droga), (2) controle positivo (incubado com 50 µg/mL de ciclofosfamida) e (3) experimental (tratado com 1 µg/mL da oncoproteína recombinante E6 do BPV-1). Todas as culturas foram estabelecidas na ausência de antibiótico. O material foi incubado por uma hora em estufa a 37 ºC, de acordo com Araldi et al. (2014c, 2015b). Após este período, os tubos foram centrifugados a 390 g por um minuto em centrífuga Hettich Mikro 22R (Berlim, Alemanha), descartando-se o sobrenadante. Um volume de 10 μL (0,8 X 108 _{células/mL) do material}

centrifugado foi transferido para tubos de polipropileno de 0,2 mL e acrescido de 75 μL de agarose de baixo ponto de fusão (LMA - low melting agorose) a 37 C. O volume final de 85 µL da suspensão celular foi aspirado com auxílio de pipeta e transferido para as lâminas pré-cobertas com NMA a 1,5%. As demais etapas deste método foram realizadas conforme descrito na seção 5.1.3.