A membrana corioalontoide do ovo de galinha fecundado (CAM) compreende uma vasculatura funcional que apresenta similaridade com as mucosas de mamíferos, e devido a isso o HET-CAM tem sido proposto como um modelo para simular a resposta de tecidos vivos a uma substância teste, sem uso de animais (Bagley, Waters, Kong, 1994). Os efeitos agudos induzidos por uma droga nos vasos sanguíneos e nas proteínas constituintes da CAM simulam os efeitos induzidos pela mesma substância quando aplicado o teste de olho de coelho. HET-CAM apresenta vantagens, tais como aceitabilidade como teste não animal, simplicidade e rapidez em sua execução, sensibilidade e por ser relativamente barato (Luepke, 1985; Vargas et al, 2007).
Na Alemanha e na França, o método de HET-CAM foi oficialmente aceito como um ensaio in vitro válido, para predição de substâncias irritantes graves (Steiling et al 1999). As leis que regulam a experimentação animal permitem protocolos com embriões de galinha com até 10 dias de fecundados sem autorização dos comites de experimentação animal. (Bagley, Waters, Kong, 1994; Luepke, 1985; Vargas et al, 2007).
As substâncias testes foram avaliadas separadamente quanto ao seu grau de irritabilidade. Para cada amostra foram realizadas cinco medições avaliando o surgimento, em segundos, dos parametros característico de lise, hemorragia e coagulação , resultados expressos na Tabela 8. Os valores do tempo em segundos foram adicionados na equação 8 descrita na metodologia a fim de avaliar o potencial de irritação.
Tabela 8- Determinação do potencial de irritação pela presença dos parâmetros lise, hemorragia e coagulação da quitosana de alto e médio peso molar (QAB), óleo essencial de Cymbopogon martini 1% (EOCM) e associação entre as substâncias QAB + EOCM 1% pelo teste da membrana corioalontóide do ovo. Controle positivo: lauril sulfato de sodio 1% (LSS1%).
Parametros de Irritabilidade da CAM
Substâncias testes
EOCM 1% QAB Associação
QAB + EOCM LSS1% Lise 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 6.0 ±1.0 Hemorragia 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 48 ±3.0 Coagulação 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 63 ±3.0 Potencial de irritação 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 17.74 ± 0.4 Não-irritante: 0.0-0.9; pouco irritante: 1.0-4.9; Irritante: 5.0-8.9 e Severamente irritante: 9.0-21.0
O composto de quitosana (QAB) não apresentou quaisquer dos parâmetros de irritação, sendo considerado não irritante. A quitosana é um biopolímero de natureza hidrofílica capaz de apresentar degradação através de enzima humanas, dessa forma sendo considerado biocompatível e biodegradável (AHMADI et al., 2015). Estes resultados mostraram-se de acordo com os obtidos pelo grupo de estudo do Laboratório de Microbiologia da Universidade Federal da Paraíba (UFPB) (STAMFORD et al., 2013).
O OECM a 1%, bem como a associação entre QAB + OECM 1% não apresentaram nenhum dos sinais de irritação estabelecidos pela metodologia do HET-CAM, sendo ambos considerados não irritantes. A incorporação de OEs a possíveis agente carreadores superam as limitações relacionadas a baixa solubilidade dos óleos em água, assim como aumenta a estabilidade física dos compostos e podem melhorar a bioatividade do óleo assim como a redução de possíveis reações indesejadas (SEVERINO, et al., 2014).
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS
De acordo com os resultados obtidos nesse trabalho, a mistura entre a quitosana de alto e de baixo peso molar, mostrou-se um composto com todas as características esperadas, sendo um polímero semi-cristalino, peso molar baixo e com grau de desacetilação de 80,66%, de fácil manipulação e uso. Essas características encontradas na QAB influenciam na sua ação antimicrobiana como também na interação com as moléculas do OECM. Tanto a QAB como o OECM não demonstraram potencial irritante através do teste HET-CAM, o mesmo foi demonstrado após a associação destas duas substâncias. Nos testes antimicrobianos o OECM se mostrou mais eficaz contra S. aureus, contudo tendo apenas ação bacteriostática. O composto de quitosana se mostrou mais eficaz contra E. coli, na associação entre o QAB + OECM, o resultado mais significativo ocorreu na E. coli, onde ocorreu redução da concentração inibitória mínima do OECM. Contudo é importante salientar que a associação QAB + OECM conferiou ao óleo um efeito cida, não observado com o mesmo puro. Através do FIC, a associação teve um papel indiferente. Diante do exposto, pesquisas deverão ser feitas para elucidar o mecanismo de ação da associação da QAB com o OECM frente a bactérias gram negativas, assim como a toxicidade da QAB e do OECM deve ser investigada mais detalhadamente.
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