Testes biológicos

3.6.1 Toxicidade frente às formas amastigotas intracelulares e tripomastigotas do

Trypanosoma cruzi

Os ensaios de atividade anti-Trypanosoma cruzi foram realizados, em colaboração, com a Dra. Maria de Nazaré C. Soeiro do Laboratório de Biologia Celular, Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ - RJ. Os testes, in vitro, objetivaram verificar a ação das fluorquinolonas e seus complexos sobre as formas evolutivas relevantes para a infecção humana (formas tripomastigotas sanguíneas e amastigotas intracelulares da cepa Y). As soluções dos compostos foram preparadas

na concentração de 50 mmol L-1, utilizando água como solvente e foram armazenadas à 4 ºC até a

realização dos experimentos. Os ensaios (mínimo de três ensaios) foram realizados, em duplicatas.

As formas tripomastigotas foram obtidas, a partir de punção cardíaca de camundongos

suíços previamente infectados (após eutanásia em câmara com saturação de CO2), durante o pico

da parasitemia. A purificação dos parasitos foi realizada por centrifugação diferencial. Para obtenção de células musculares cardíacas (culturas de células de mamífero), ventrículos de corações de embriões de camundongos (linhagem Swiss Webster) foram fragmentados e submetidos à dissociação enzimática, seguida de análises ao microscópio óptico para verificar sua viabilidade. Posteriormente, realizou-se a inativação enzimática e, após centrifugação, o sedimento foi ressuspenso em meio adequado para a manutenção das culturas em atmosfera de CO2. Os ensaios foram realizados em diferentes condições e com concentrações crescentes dos compostos, com comparação direta com o efeito de benzonidazol (fármaco-referência) (MEIRELLES et al., 1986).

Para analisar o efeito dos fármacos sobre as formas amastigotas (análise in vitro sobre formas intracelulares do parasito), após 24 horas de cultivo, cardiomiócitos foram infectados com tripomastigotas sanguíneas (razão parasita célula de 10:1) e tratados ou não por 24-72h com diferentes concentrações dos compostos, seguido de diluições seriadas. Após o tratamento, as culturas foram lavadas, fixadas, coradas e montadas em permount de modo a se quantificar o

percentual de células hospedeiras infectadas e avaliar o número de parasitas por células. Foi utilizada como parâmetro de análise a concentração necessária para inibir 50% da atividade (IC50) para os compostos em estudos, ou seja, os valores mínimos de concentração capaz de inibir em 50% o crescimento do T. cruzi.

3.6.2 Toxicidade frente às linhagens tumorais A20, B16-F10, K562, MCR-5 e L919

Os ensaios de atividade antitumoral foram realizados, em colaboração, com a Profa. Elisângela de Paula Silveira Lacerda do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Goiás. Para os ensaios de citotoxicidade foram utilizadas as linhagens tumorais estabelecidas A20 (Linfoma murino), B16-F10 (Melanoma murino), K562 (Leucemia mielóide humana) e como células normais (controle), utilizou-se a linhagem estabelecida MCR-5 (fibroblasto de pulmão humano) e L919 (Fibroblasto de pulmão murino).

Linhagens celulares e manutenção do cultivo celular

As linhagens celulares foram mantidas em cultura a 37 ºC, 5% CO2 em meio RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute da GIBCO) ou DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) suplementado com 10% de soro fetal bovino e antibióticos, segundo protocolo estabelecido pela

American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, EUA).

Ensaio de viabilidade celular por Ensaio de MTT (brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5- difeniltetrazólio)

As células foram semeadas em placas de 96 poços. No dia seguinte, concentrações

crescentes (0,2 a 200 µmol L-1) de fármacos foram adicionadas, incubando-se a seguir por 48

horas em incubadora com 5% de CO2 e a 37 ºC. Ao final do período adiciona-se a solução de MTT (brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio), deixando-se em incubação por 5 horas para metabolização do reagente. A solubilização do reagente formazan foi feita com dodecil sulfato de sódio (SDS). A quantificação de densidade óptica (DO) foi medida por espectrofotômetro. O valor de IC50 foi determinado por meio da curva dose resposta utilizando o programa estatístico GraphPad Prism 4.02 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

TRABALHO EXPERIMENTAL 36

Citometria de fluxo: Avaliação das fases do ciclo celular.

Células tratadas e células controle mantidas em cultura líquida foram lavadas com tampão fosfato-salino (PBS) com EDTA e fixadas em 1% de etanol gelado a 70%, sendo posteriormente

tratadas com RNAse por 30 minutos e em seguida coradas com 5 µg mL-1 de solução corante de

iodeto de propídio. Após o período de incubação, a intensidade da fluorescência foi determinada através de citometria de fluxo quantitativa, utilizando o Citômetro de Fluxo FACS Callibur (Becton Dickinson®, San José, CA).

Eletroforese em gel de Agarose

Para a extração de DNA em gel de agarose as células de linhagens tumorais e normais foram incubadas com diferentes concentrações dos compostos em estudo por 48 h, incubados na estufa com 5% de CO2 e à 37 ºC. As células foram retiradas do tratamento e centrifugadas e lavadas com PBS seguindo o protocolo de SAMBROOK et al. (1989). O DNA foi transferido para um gel de agarose, que foi submetido a eletroforese. O DNA foi visualizado através de transiluminação por ultravioleta, após a coloração por brometo de etídio utilizando um sistema

de imageamento Omega® (UltraLum Inc. Claremont, CA, EUA).

Análise estatística

Para comparação entre os grupos tratados e controle foi utilizado Análise de Variância (Anova), segundo um único critério e pós-teste Dunnet’s (software GraphPad Prism V4) com grau de significância de 95% (p<0,05).

3.6.3 Bactérias e Fungos

Para avaliar a atividade antibacteriana e antifúngica dos complexos de Zn(II) e Mn(II) obtidos foram usadas fungos e bactérias da coleção do LABB (Laboratório de Biotecnologia e Bioensaios), Departamento de Química – UFMG. Foram usados os fungos Candida albicans,

Penicillium citrinum, Cladosporium cladosporioides, Aspergillus niger e Microsporum gypseum

e as bactérias Bacillus cereus, Citrobacter freundii, Escherichia coli, Listeria monocytogenes,

Para os testes foram usadas microplacas constituídas por 96 poços (8 linhas e 12 colunas). As microplacas foram preparadas da seguinte forma:

• Pipetou-se 100 µL da solução trabalho nos poços e, a seguir 100 µL do inóculo do

microrganismo ou da suspensão de esporos para avaliar a inibição dos microrganismos;

• Pipetou-se 100 µL da solução trabalho nos poços e, a seguir 100 µL de água destilada

estéril para o controle dos extratos.

• Pipetou-se 100 µ L do meio de cultura BHI nos poços e, a seguir 100 µL do inóculo do

microrganismo ou da suspensão de esporos para o controle dos microrganismos.

• Pipetou-se 100 µL do meio de cultura BHI nos poços e, a seguir 100 µL de água destilada

estéril para o controle da esterilidade do meio de cultura.

A disposição das amostras na microplaca para os ensaios antibacterianos e antifúngicos, onde foram avaliados os complexos de Zn(II) e Mn(II), ligantes e seus respectivos sais a uma

concentração fixa de 250 µg mL-1, pode ser visualizada como exemplo na Figura 3.1.

As microplacas preparadas foram incubadas a 37 ºC durante 48 horas. Realizaram-se leituras em leitora de ELISA (Thermoplate, modelo: TP-READER), em comprimento de onda fixo de 492 nm com 24 horas para os testes antibacterianos e 48 horas para os fungos filamentosos.

Figura 3.1 – Representação de microplaca do ensaio antibacteriano e antifúngico com as amostras a uma concentração fixa.

RESULTADOS E DISCUSSÃO 38

4. Complexos de Au(III) de algumas fluorquinolonas: síntese, caracterização, testes de