Testes comportamentais

5.7.1. Mensuração da nocicepção térmica seriada com morfina

Aos 60 dias pós-natal (DPN), os machos filhos de mães eutireoideas e de mães com hipotireoidismo gestacional foram submetidos à avaliação da nocicepção supraespinhal por meio do aparato da Placa quente (AVS, Brasil), aquecida a 52±0,2°C. A avaliação da resposta nociceptiva foi realizada por meio da medida do lapso de tempo entre a aplicação do estímulo térmico e o momento da lambida vigorosa da pata traseira. Esse modelo permite obter informações sobre o mecanismo de regulação da nocicepção

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térmica, uma vez que o parâmetro avaliado (i.e.: reflexo de retirada e lambedura vigorosa da pata traseira) é de integração medular e supra-medular. Após isto, estes mesmos animais receberam injeção intraperitoneal de 3 mg/kg de morfina (10mg/mL) e foram novamente alocados na placa quente 30, 60, 90 e 120 minutos após a injeção desta droga para avaliação da latência térmica nociceptiva (Sluka, 2000). O máximo tempo de exposição ao calor, para evitar danos à pele foi de 20 s (Song et al., 2015).

A avaliação de todos os animais na placa quente foi filmada e os vídeos foram assistidos por um avaliador cego que determinou a latência de cada animal incluído no estudo, tanto no tempo basal quanto nos tempos pós morfina. Vale ressaltar que todos os animais foram ambientados (dois dias antes do experimento por 5 minutos cada) ao aparato dois dias antes do dia do experimento.

5.7.2. Mensuração da nocicepção térmica após manipulação farmacológica crônica

Aos 60 dias pós-natal (DPN) os machos filhos de mães eutireoideas e com hipotireoidismo gestacional foram submetidos à avaliação da nocicepção supraespinhal por meio da placa quente. Os filhotes foram alocados individualmente sobre uma placa metálica (AVS, Brasil) aquecida a 52±0,2ºC, desencadeando o reflexo de lambida da pata traseira. O máximo tempo de exposição ao calor, para evitar danos à pele foi de 30s (Altun et al., 2015; Jiang et al., 2015; Zhang et al., 2016). A avaliação desta resposta foi realizada por meio da medida do lapso de tempo entre a aplicação do estímulo térmico e o momento da lambida da pata (como descrito anteriormente).

Os filhotes de mães eutireoideas bem como os das mães com hipotireoidismo foram submetidos a este procedimento aos 60 dias de nascidos (medida basal). Em seguida, os mesmos animais avaliados na medida basal receberam injeção intraperitoneal de um inibidor da recaptação pré-sinaptica de serotonina (sertralina-10 mg/kg, i.p.) por 21 dias (Zanoveli et al., 2007), antagonista do receptor de glutamato N- metyl D-aspartato (memantina -10 mg/kg, i.p.) dose única (Ahmed et al., 2004) e inibidor da tirosina hidroxilase (Alpha Methyl Para-Tirosina-AMPT, 100 mg/kg, i.p.; Sigma Chemical Company) dose única (Bobinski et al., 2015). Após isto, os animais

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foram novamente alocados na placa quente para avaliação da latência nociceptiva 30min após a injeção destas drogas nos dias 1, 3, 11 e 21 para sertralina e apenas no primeiro dia para memantina. Para o AMPT, os animais foram alocados na placa quente três horas após a administração desta droga, em dose única.

A sertralina faz parte das drogas que são inibidoras da recaptação de serotonina (SSRIs) e esta age, especificamente, bloqueando a recaptação pré-sináptica de serotonina no SNC (Fitzgerald & Bronstein, 2013). A memantina é um antagonista não competitivo de receptor N-methyl- D-aspartate (NMDA), com afinidade fraca para moderada (Kavirajan, 2009). A memantina age com potência moderada como um antagonista nos receptores do tipo 5-hidroxitriptamina 3 (5-HT3) e exerce um efeito mais fraco, porém significativo, como um antagonista no receptor nicotínico de acetilcolina in vitro (Kavirajan, 2009). Neste sentido, em concentrações clinicamente relevantes, foi estabelecido que ela bloqueia os receptores nicotínicos alfa-7 de acetilcolina de maneira não competitiva, sendo mais eficientes para esta finalidade do que para o bloqueio dos receptores de NMDA isoladamente (Aracava et al., 2005). Além disso, dados sugerem que a administração de memantina tem um efeito estimulante sobre a sinalização colinérgica através dos receptores muscarínicos (Drever et al., 2007).

AMPT é um inibidor da tirosina hidroxilase, uma enzima limitante para a biossíntese das catecolaminas, que resulta na redução funcional de dopamina e norepinefrina (Daubner et al., 2011). A tirosina hidroxilase catalisa a hidroxilação de tirosina para L-DOPA (Molinoff & Axelrod, 1971) (Figura 33).

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Figura 33. Vias de biossíntense das catecolaminas.

A avaliação de todos os animais na placa quente foi filmada e a latência de destes foi determinada somente após os vídeos terem sido assistidos por um avaliador cego. Vale ressaltar que todos os animais foram ambientados ao aparato nos dois dias que antecediam o experimento.

5.7.5. Campo aberto

O campo aberto (confeccionado pelo experimentador) é um aparato circular de polietileno com fundo preto, medindo 95 cm de diâmetro e 60 cm altura, sem teto. Foi posicionada uma câmera sobre o campo aberto a uma altura de 230 cm. A câmera foi conectada a um computador equipado com um programa de rastreamento de animais (Anymaze, Stoelting, USA) para registro dos parâmetros comportamentais. O fundo do campo aberto tinha a cor preta para aumentar o contraste, favorecer o desempenho do programa e com baixa luz, a fim de não proporcionar ansiogênese.

Os animais foram colocados no centro do campo circular e tiveram seus comportamentos avaliados durante 5 minutos. Este teste em baixa luminosidade tem, como principal pressuposto, a avaliação do comportamento exploratório, através da

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medida da ambulação e orientação quanto ao espaço e tempo, pois existe uma tendência de diminuição exploratória ao longo do tempo (Genaro & Schmidek, 2002).

A avaliação comportamental incluiu a distância percorrida total (distância em metros do percurso realizado pelo animal). Cada animal foi avaliado separadamente e o aparato foi limpo com solução de álcool a 10% ao final de cada uso. É importante salientar aqui que todos os animais, logo após o teste da Placa quente, passaram pelo campo aberto a fim de garantir que as possíveis alterações comportamentais observadas nos animais estudados quando expostos a placa quente, foram decorrentes de alterações

na circuitaria nociceptiva e não de distúrbios motores.

È importante ressaltar aqui que todos os testes comportamentais (placa quente com as diferentes drogas e o campo aberto) foram realizados por um único investigador, que foi treinado previamente para utilização dos aparatos e que foi mantido cego ao longo de toda coleta de dados.