Testes Comportamentais

Individualmente, os pintos foram submetidos a testes de comportamento exploratório em campo aberto e de alternância em labirinto em “T”, em sessões de 5 minutos, no período matutino do DPN1 e do DPN5, para avaliação da atividade locomotora, exploratória e memória. A dose utilizada, o período de

exposição (pré e/ou pós-natal), a idade e a espécie animal estudada devem ser considerados em trabalhos relativos ao comportamento (BORNSCHEIN et al., 1980; BURBACHERet al., 1990; 2005).

1) Comportamento exploratório em campo aberto: Utilizado para medir a atividade exploratória (sendo a locomoção um dos parâmetros mais usados) e emocionalidade (o campo aberto per se é estressante) (KIM et al., 2000; DORÉ et al., 2001). Consiste numa caixa de madeira com frente de vidro (40 x 60 x 50 cm) e chão dividido em 25 quadrados iguais.

De acordo com NAHAS (1999), a atividade exploratória pode ser avaliada através da exposição do animal a alterações ambientais discretas e localizadas, introduzindo objetos novos no ambiente, onde o animal poderá exibir uma ampla variedade de respostas, como ataque, fuga, imobilização, manuseio e contato com o objeto. Nesse sentido realizamos quatro testes de campo aberto nos pintos dos grupos experimentais:

a) Teste de campo aberto padrão: Permitiu o registro do tempo de latência para sair do quadrado central, número de movimentos exploratórios (cruzamento e movimentos de cabeça e pescoço), quantidade de bolos fecais eliminados durante a tarefa e autolimpeza (Figura 7A).

b) Teste de campo aberto com imobilização prévia em caixa escura: No quadrado central do campo aberto, foi colocada uma redoma de plástico, com 10 cm de diâmetro, de cor preta sobre o pinto, de modo que este ficou preso num espaço escuro e limitado (ambiente estressante). Após 2 minutos, a redoma foi

retirada e registrou-se o comportamento do animal conforme descrito no item “a” (Figura 7B).

c) Campo aberto com estímulos: Em cada quadrante do campo aberto foram colocados objetos diferentes (vidro, plástico, madeira e papelão). O pinto foi colocado no quadrado central e registrou-se o tempo de latência para sair do quadrado e o tempo exploratório total dos objetos (Figura 7C).

d) Campo aberto com estímulo em plataforma elevada: No quadrante anterior esquerdo do campo aberto foi colocada uma plataforma (15 x 15 x 2 cm), sobre a qual foi colocado um estímulo atrativo (comida). O pinto foi colocado no quadrado central e registrou-se o tempo de latência para sair do quadrado, o número de tentativas do animal para alcançar o estímulo e o tempo despendido para atingí-lo (Figura 7D).

2) Teste da alternância espontânea: Esta tarefa é usada para avaliar a aprendizagem e a memória espacial (MELLO et al., 1998; DORÉ et al., 2001). O labirinto em “T”, requer que o animal escolha o braço opositor ao primeiro braço anteriormente selecionado (DORÉ et al., 2001). Realizado numa caixa de madeira com formato em “T”, com braços menores medindo 20 cm e braço maior 34 cm de comprimento, com inclinação de 20º. Tanto os braços menores como o braço maior mediam 8 cm de largura e 20 cm de altura. Foram realizados dois testes:

a) Teste do labirinto em “T” sem estímulo: O pinto foi colocado na extremidade do braço maior e registrou-se o tempo que este levou para entrar em um dos braços menores. Então, o pinto foi retirado do braço menor e recolocado

Figura 7 – Modelos de campo aberto utilizados para estudo de Gallus domesticus realizado no DPN1 e DPN5. (A) Campo aberto padrão. (B) Campo aberto com imobilização prévia em caixa escura. (C) Campo aberto com estímulos. (D) Campo aberto com estímulo em plataforma elevada.

B

C A

na extremidade do braço maior e novamente registrou-se o tempo que o mesmo levou para alcançar um dos braços menores. O teste foi suspenso assim que o pinto alternou o braço escolhido inicialmente ou quando se completaram os 5 minutos de teste. Foram registrados o número de tentativas e o tempo despendido para alternar espontaneamente os braços menores do labirinto em “T” (Figura 8).

b) Teste do labirinto em “T” com estímulo: Realizado conforme descrição do item anterior, na presença de um feixe luminoso no braço menor direito do labirinto em “T”, a fim de verificar o comportamento do pinto na presença da luz e avaliar sua acuidade visual (Figura 8).

Encerrados os testes comportamentais (DPN5), tanto os pintos do grupo tratado com metilmercúrio, quanto os do grupo controle foram subdivididos em dois lotes, sendo um para os procedimentos histológicos e o outro para os procedimentos bioquímicos.

Figura 8 – Modelo de labirinto em “T” utilizado para estudo de Gallus domesticus realizado no DPN1 e DPN5.

3.4 Procedimentos Histológicos

Pintos do grupo tratado (n = 7) e do grupo controle (n = 7) no DPN5 foram anestesiados com vapor de éter etílico por 06 minutos e submetidos à perfusão intracardíaca na primeira fase com uma solução salina e em seguida com uma solução fixadora de Carnoy-sulfeto. O encéfalo foi retirado da caixa craniana, dissecado, pesado, seccionado sagitalmente, mantido em solução Carnoy-sulfeto por 45 horas, e após, em álcool absoluto por 48 horas (SANTOS, 1999). Os encéfalos foram preparados para a microscopia de luz de acordo com as seguintes etapas:

1. Desidratação: Em álcool absoluto por 01 hora efetuando-se uma troca, foi gotejado xilol até obtenção de álcool-xilol (50%) por 20 minutos.

2. Diafanização: Imersão em xilol até tornarem-se translúcidos.

3. Inclusão e Emblocamento: Imersão em parafina a 57ºC por três vezes (30 minutos cada). Após solidificação em temperatura ambiente, os blocos de parafina foram removidos dos moldes, aparados e acoplados ao micrótomo rotativo.

4. Montagem das Lâminas: Os blocos foram seccionados (6µm), os cortes distendidos em banho-maria (37ºC), colocados sobre lâminas e mantidos em local apropriado para secagem.

5. Desparafinização: Em xilol, seguido de xilol/álcool, hidratados em álcool (seqüência decrescente de álcool absoluto até álcool 70%) e em água destilada.

6. Coloração: Foram utilizadas as seguintes técnicas:

a) Hematoxilina - Eosina (BEÇAK & PAULET, 1976) - Foi empregada como controle histológico. As lâminas foram coradas com hematoxilina de Harris (3 minutos) e lavadas em água de torneira. Após, imersas em eosina aquosa a 0,5% (1 minuto).

b) Violeta de Cresila (ONISHI, 1999) - As lâminas permaneceram imersas por 15 minutos em violeta de cresila e posteriormente foram lavadas em água destilada (3 minutos). Esta técnica evidencia o citoplasma de neurônios, destacando os corpúsculos de Nissl, compostos basicamente por RNA. Desta maneira, tal coloração serve como indicador da viabilidade neuronal, pois, na ocorrência de lesões esses corpúsculos podem desaparecer (cromatólise) (SCORZA et al., 2005).

c) Timm (PEDERSEN et al., 1999) - Foi utilizada para análise da deposição do metilmercúrio no tecido nervoso. As fatias montadas em lâminas permaneceram por 90 minutos na solução de desenvolvimento físico (goma arábica, tampão citrato de potássio, hidroquinona e lactato de prata), posteriormente foram lavadas em água de torneira e contracoradas com hematoxilina de Harris (1 minuto).

7. Desidratação e Montagem das Lâminas: Realizada em série etanólica crescente (70 até 100%), álcool-xilol e xilol, e após, montadas com bálsamo do Canadá.

8. Análise das lâminas: Os cortes sagitais do encéfalo nas diferentes técnicas foram analisados ao microscópio de luz (100X, 400X e 1000X) e a partir desta análise foram realizados esquemas e fotografias.

Neste estudo, a investigação microscópica dos efeitos do metilmercúrio foi realizada em duas regiões do encéfalo: o mesencéfalo e o cerebelo. A descrição morfológica foi organizada de acordo com as características apresentadas no citoplasma, núcleo, nucléolo e substância de Nissl dos neurônios.