Testes comportamentais

5.4.1- Consumo alimentar:

Para testarmos o impacto do tratamento sobre o consumo alimentar, os ratos foram mantidos em gaiolas individuais para medir o consumo alimentar em intervalos de 4 horas.

Antes da administração i.p. da Dexametasona, o peso corporal foi obtido para o cálculo da dose da droga a ser aplicada. Após as injeções, os ratos tratados com a Dexametasona ou veículo tiveral livre acesso a quantidades de dieta previamente pesados. Os pesos das dietas foram registrados às 6:00, 10:00, 14:00, 18:00 horas. O consumo alimentar foi obtido através da subtração do peso da cota oferecida da dieta pelo peso da cota rejeitada com o auxílio de uma balança eletrônica com capacidade para 4 Kg e sensibilidade 0,1g (Marte, modelo S-4000). Os valores foram expressos como consumo alimentar relativo [Consumo (gramas)/Peso corporal (gramas) x 100].

5.4.2- Sequencia Comportamental de Saciedade (SCS):

A técnica de Sequência Comportamental de Saciedade, é um experimento que permite a avaliação do ponto de saciedade. Para a sua realização, os animais tratados com i.p e i.c.v. de dexametasona ou veículo foram mantidos em gaiolas individuais. As 4 horas prévias ao experimento, os animais foram mantidos em jejum. Como mencionado, a depender do tipo de via de administração, a droga foi aplicada em intervalos diferentes. Para a via i.p., as injeções foram aplicadas 1 hora antes do início do teste de SCS e para a via i.c.v., 30 minutos antes. Passados este intervalo, foi ofertada uma cota de peso conhecido da dieta padrão de biotério, e por um período de uma hora, o comportamento dos animais foi analisado quanto aos seguintes parâmetros:

1- Tempo de latência: intervalo que compreende o tempo, em segundos, prévio ao início da alimentação.

2- Tempo de alimentação: tempo, em segundos, em que os animais passam se alimentando. 3- Tempo de limpeza: tempo, em segundos, em que os animais passam no comportamento de

limpeza.

4- Tempo de descanso: tempo, em segundos, em que os animais passam descansando e dormindo.

5- Ponto de saciedade: ponto no tempo em que há interseção entre as linhas referentes ao tempo de alimentação com a do tempo de descanso.

6- Consumo alimentar relativo: diferença entre a cota de dieta oferecida e a cota de dieta rejeitada, dividida pelo peso corporal.

5.4.3-Atividade Locomotora (Campo aberto):

5.4.3.1- Procedimentos

Para avaliar as consequências da ativação dos receptores nucleares de glicocorticoides e RER-ERBα sobre o gasto energético e sobre o comportamento ansioso, foi realizado o teste do campo aberto. O gasto energético é dividido em três componentes: a taxa metabólica basal, a produção de calor induzida pela dieta e o gasto energético pela atividade física, que compreende as calorias utilizadas para o movimento [22]. Neste estudo, o teste de atividade locomotora no campo aberto foi realizado para avaliar o gasto energético durante a atividade física seguindo o método descrito por Aragão et al., (2011) e Silva et al., (2016) [23,24]. Neste método, as calorias gastas pelo animal são calculadas a partir de valores de energia cinética obtidos a partir de parâmetros de locomoção (Aragão et al., 2011; Silva et al., 2016). A atividade física já foi usada por outros autores como um indicador de gasto energético em ratos tratados com sibutramina [25]. No atual estudo, os ratos foram colocados no centro de um campo e seu livre movimento foi registrado por um aparelho de monitoramento por 5 minutos, um intervalo de tempo bem aceito entre os autores [25]. Ainda, o teste de campo aberto nos permite analisar o comportamento ansioso, através da avaliação do tempo em que os animais passam nas três áreas do campo [26]. Ratos, apresentam um comportamento denominado de tigmotatismo, que corresponde a andar próximo a paredes. O aumento ou diminuição no tempo de permanência na área central do campo aberto relaciona-se, respectivamente, com diminuição ou aumento dos níveis de ansiedade [27]. Na troca dos animais, o campo foi limpo com solução de álcool a 10%, e o etil vinil acetato (EVA) trocado, para eliminar odores que possam interferir no comportamento do animal seguinte.

5.4.3.2- Sistema de captação de imagens:

O campo aberto circular utilizado, é delimitado por paredes de 30 cm de altura, com superfícies internas de cor preta e superfície de EVA, também preta, com objetivo de facilitar a locomoção do animal e proporcionar um maior contraste com este (Figura 8A e B). A

monitoração do movimento do rato ocorreu através de imagens digitais capturados sob luz infravermelha.

No teto da sala, acima do centro do campo aberto, foi fixada uma câmera digital (VTR®6638 – CCTV System) que filma o animal enquanto este se movimenta (Figura 8C). Sua distância do local de fixação até o solo do campo é de 2,40 m. A câmera possui sensor de infravermelho e um LED de iluminação. Apresenta resolução de 420 linhas, velocidade entre 1/60 e 1/100 s, e sua sensibilidade permite registrar imagens com iluminação mínima, até 0,1 lux. A câmera foi acoplada ao computador através de placa de captura.

Figura 8: Esquema do método de atividade locomotora. (A) Vista superior do campo aberto em ambiente claro; (B) Imagem do rato no campo; (C) Representação esquemática do sistema de monitoramento no campo aberto; (D) Câmera de captura das imagens dos animais.

Através de um software de captura, o filme é enviado ao computador no qual possui uma taxa de captura de 30 quadros por segundo, tendo o vídeo 240 pixels de altura e 320 pixels de comprimento (Figura 8D). Os vídeos foram salvos no formato AVI, sendo posteriormente divididos em quadros, para análise. No software Paint®, é confeccionado uma máscara com o

objetivo de isolar a imagem do animal no campo dos objetos ao redor. A análise das imagens obtidas a partir de cada vídeo é feita através de uma plataforma de software em MATLAB. Através de uma interface, o avaliador introduz dados para registro do animal e informações que seriam utilizadas para análise dos quadros.

Devido à diferença de cor entre o campo aberto e o animal, o programa utiliza o reconhecimento da intensidade de pixels para estabelecer todos os pontos que formam a imagem do animal, determinando seu ponto médio. Este ponto passa a representar o animal. Dentro do campo aberto, a análise da atividade locomotora é avaliada através das seguintes variáveis:

- Distância percorrida (m): corresponde ao somatório de todos os deslocamentos realizado pelo animal;

- Velocidade média (m/s): relação do deslocamento total pelo tempo em que o animal permanece em movimento. Fórmula: ΔS/ΔT, onde ΔS corresponde ao deslocamento total em metros, e ΔT é o tempo total de análise menos o tempo de imobilização em segundos.

- Potência média (mW): potência produzida durante o período de deslocamento. Fórmula: mV²/ΔT, onde m corresponde a massa do animal em gramas, V é a velocidade média em metros/segundos, e ΔT a análise total do tempo menos o tempo ocioso em segundos.

- Tempo imóvel (s): tempo total que o animal permanece imóvel no campo aberto. - Número de paradas: número total de paradas realizadas no campo.

- Tempo de permanência nas áreas (s): o campo aberto é dividido, virtualmente, em três áreas (central, intermediária e periférica). Sendo determinado o tempo total de permanência dos animais nessas áreas.

- Relação tempo de imobilidade/número de paradas (s): relação entre o tempo total que o animal permanece imóvel no campo aberto e o número total de paradas.

- Energia gasta: refere-se ao gasto de energia cinética, cuja fórmula é m.V2/2, onde m é a massa corporal e V a velocidade média. Trata-se da energia que o animal gasta com sua atividade realizada no campo aberto durante os 5 minutos que ele permaneceu no campo.