TESTES DE ATIVIDADE ANTIVIRAL

Os estudos de atividade antiviral das galactanas sulfatadas utilizadas neste trabalho foram realizados no Departamento de Virologia, Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes, Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ (Rio de Janeiro) pelo grupo da Profª. Drª. Maria Teresa Villela Romanos, com a qual o grupo de Química de Carboidratos de algas marinhas da UFPR mantém colaboração

científica fornecendo amostras de polissacarídeos sulfatados e aliando os resultados de atividade antiviral com os de estrutura química fina.

3.15.1 Frações de polissacarídeos testadas

Para a determinação da atividade antiherpética foram utilizadas as seguintes frações:

- FCS-3: galactana sulfatada obtida da alga P. flagellifera;

- AHS e LHS: galactanas sulfatadas obtidas das algas L. aldingensis e L. filiformis, respectivamente;

- Q2-0,6: fucana sulfatada obtida da alga parda Lobophora variegata.

3.15.2 Células e Vírus

Foram utilizadas para os ensaios antivirais células Vero (linhagem de células de rim de macaco verde africano), crescidas em meio essencial mínimo (MEM) de Eagle suplementado com 2 mM de L-glutamina, 50 g.mL-1 de gentamicina, 2,5

g.mL-1 de fungizona e 10% de soro fetal bovino inativado por calor e mantido a 37 °C em atmosfera com 5% de CO2.

Os HSV-1 e HSV-2 foram isolados de lesões típicas nos lábios e na genitália, respectivamente, no Departamento de Virologia da Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ. Os vírus foram submetidos à reação em cadeia da polimerase (PCR - polymerase chain reaction) utilizando primers específicos para a identificação (MARKOULATOS et al., 2001).

3.15.3 Ensaio citotóxico

Para a determinação das concentrações máximas não tóxicas (CMNT), as monocamadas de células Vero foram expostas a diferentes concentrações dos polissacarídeos sulfatados (200; 100; 50; 25; 12,5; 6,25 e 3,15 mg.mL-1) e incubadas a 37 °C em atmosfera com 5% de CO2 por 48 horas. Após a incubação, alterações

microscópio óptico invertido (Leitz) e a MNTC foi determinada (WALKER et al., 1971).

A viabilidade celular foi avaliada pelo método de BOREFREUND e PUERNER (1985), baseado na captação do vermelho neutro pelas células. Brevemente, as células foram incubadas na presença de 0,01% de solução de vermelho neutro por 3 horas a 37 °C em atmosfera com 5% de CO2. Em seguida, o meio foi removido e as

células foram fixadas com formalina 4% em tampão fosfato (pH = 7,2). O corante incorporado pelas células viáveis foi eluído por uma mistura de solventes composta por metanol:ácido acético:água (50:1:49), e a captação de coloração foi avaliada por densidade óptica (OD – optical density) do eluído a 490 nm em espectrofotômetro automático (ELx800TM—Bio-TeK Instruments, Inc.). A concentração citotóxica para 50% das células em cultura (CC50) foi definida como a concentração capaz de

reduzir em 50% a captação do corante.

3.15.4 Ensaio de atividade antiviral

O método utilizado para a avaliação da atividade antiviral das galactanas sulfatadas foi o de redução do título viral. Os títulos virais foram calculados utilizando o método estatístico de Reed e Muench (1938) e foram expressos como a dose infectante para 50% da cultura do tecido (DICT50 – dose infectante para 50% da

cultura de tecido) por ml.

Inicialmente foi feita uma triagem dos polissacarídeos sulfatados quanto à atividade antiviral; as monocamadas de células Vero foram tratadas com o polissacarídeo na CMNT e uma suspensão viral (100 DICT50.mL-1) foi adicionada a

culturas de células tratadas e não tratadas com o polissacarídeo. Após 48h de incubação a 37 °C, em atmosfera com 5% de CO2, o sobrenadante foi coletado e

foram determinados os títulos virais em células tratadas e não tratadas. A atividade antiviral foi expressa como índice de inibição viral (IIV) e percentagem de inibição (PI).

O grau de atividade antiviral foi expresso em percentagem de inibição (PI). A PI foi obtida utilizando os valores do antilogarítimo de DICT50 na seguinte fórmula

(NISHIMURA et al., 1977):

3.15.5 Cinética de inibição viral

A curva de dose-resposta foi estabelecida inialmente com a CMNT, sendo os polissacarídeos sulfatados diluídos a partir dessa concentração e avaliados de acordo com a metodologia de redução do título viral em relação ao controle. O título viral encontrado em cada concentração foi plotado no gráfico da concentração dos polissacarídeos sulfatados x porcentagem de inibição (PI).

A partir desse gráfico, foi obtida a concentração efetiva para causar 50% de inibição (CE50), que foi definida como a concentração requerida para alcançar 50%

de proteção contra os efeitos citopáticos induzidos pelo vírus. O índice de seletividade (IS) foi determinado pela razão entre CC50 e CE50, que corresponde à

relação entre a concentração do polissacarídeo necessária para reduzir a viabilidade celular em 50% e a concentração de polissacarídeos capaz de causar 50% de inibição viral.

3.15.6 Mecanismos de ação

Para avaliar os mecanismos de ação foi utilizada a metodologia de titulação por plaqueamento. Brevemente, diluições logarítmicas (10-1 a 10-5) da suspensão viral (Atividade virucida) e dos sobrenadantes (Atividade sobre o receptor celular e Atividade na Penetração Viral) foram inoculadas em placas contendo monocamada confluente de células Vero. Depois de inoculadas, as células foram incubadas por 60 min. a 37ºC em ambiente com 5% de CO2. Após incubação, foi adicionado carboximetil celulose a 1,5% em MEM e as células incubadas por 48 horas. Após esse período o meio foi retirado, as células lavadas com PBS pH 7,2, fixadas com formaldeído a 4% em PBS e coradas com cristal violeta a 1% em PBS. A percentagem de inibição foi determinada comparando-se os títulos de vírus na presença (teste) e ausência (controle) das substâncias.

3.15.6.1 Atividade virucida

Uma amostra de 100 L de suspensão viral (105 DICT50.mL-1) foi adicionada a

incubadas a 37 C por 2h. Em seguida, os títulos residuais dos virus tratados ou não tratados foram determinados e a atividade virucida foi avaliada através do ensaio de redução de formação de placas de vírus e expresso como percentagem de inibição (PI).

3.15.6.2 Atividade sobre o receptor celular

Monocamadas de células Vero foram pré-tratadas com polissacarídeo na MNTC ou MEM-Eagle (controle) por 1h a 4ºC. Em seguida, as células foram lavadas 3 vezes com MEM-Eagle, em seguida, inoculadas com 100 TCID50.mL-1 de

suspensão viral e incubadas a 37 C por 48h. Após o período de incubação, o sobrenadante foi coletado e os títulos virais das células tratadas e não tratadas foram determinados; a atividade antiviral foi avaliada pelo ensaio de redução de placa de vírus e expresso como percentagem de inibição (PI).

3.15.6.3 Atividade na Penetração Viral

Monocamadas de células Vero foram inoculadas com 100 DICT50.mL-1 de

suspensões virais e incubadas por 1 hora a 4 C. Após este período, as células foram lavadas com MEM-Eagle e, em seguida, foi adicionado o polissacarídeo na CMNT ou MEM-Eagle (controle). A temperatura das culturas foi imediatamente elevada para 37 C e mantida por uma hora para permitir que ocorresse a penetração das partículas virais no interior das células. Após incubação, as monocamadas de células foram lavadas, MEM-Eagle fresco foi adicionado e as culturas foram incubadas a 37 C por 48 horas. Após incubação, o sobrenadante foi coletado e os títulos virais das células tratadas e não tratadas foram determinados e a atividade antiviral foi avaliada pelo ensaio de redução da placa de vírus e expresso como percentagem de inibição (PI).