Testes de corte a laser na folha de pedra

Cette protéine a été cristallisée avec une résolution de 2.1 Â (Petosa et al., 1997)

(Figure I. 10). Elle a une dimension de 100x50x30 Â et s'organise essentiellement en feuillets

P anti-parallèles. Elle est constituée de quatre domaines. Le site de fixation pour le récepteur

est localisé dans le domaine 4, le site impliqué dans la translocation (FFD^^^) dans le domaine

2, et le site sensible à la flirine dans le domaine 1.

Le pH acide provoque l’oligomérisation de PA63 (Milne et al., 1994). L’étude par

microscopie électronique révèle une structure typique d’anneau compact (Figure I. 11). Ces

structures sont des oligomères de PA63 avec un diamètre extérieur de 14 nm et une cavité

centrale d'un diamètre de 2 nm. La masse d'un oligomère estimée par STEM (“scanning

transmission electronic microscopy”) en utilisant le virus de la mosaïque du tabac comme

standard est de 440 kDa. Cette masse est celle d’un heptamère de PA63 (Milne et al., 1994).

Cet heptamère a récemment été cristallisé (Petosa et al., 1997) (Figure I. 12). Il forme un

anneau creux de 160 Â de diamètre et de 85 Â de haut. Le passage central a un diamètre

moyen de ~35Â, mais à certains endroits, il se rétrécit jusqu’à ~20Â. Ce passage est polaire et

chargé négativement. Les domaines 1' et 2 sont à l'intérieur et les domaines 3 et 4 à l'extérieur.

Figure I. 12. Structure cristallographique de l’heptamère de PA63. a, le profil axial, b, le

profil latéral sans les trois monomères à l’avant pour mieux révéler l’intérieur de

l’heptamère. (Petosa et al., 1997).

PA63

Figure I. 13. Effet du pH sur la fluorescence du TNS incubé avec PA63. La protéine

PA63 est diluée jusqu’à 1 }j.M dans 150 pM TNS aux différents pHs. La longueur d’onde

d’excitation est de 366 nm (Koehler & Collier, 1991).

Chapitre I: Introduction

L’oligomérisation de PA63 dans la membrane lipidique des cellules CHO a également

été mise en évidence par Milne et al. (1994). *^^I-PA est incubé avec des cellules CHO pendant

40 minutes à 37 °C; les cellules sont solubilisées dans une solution de SDS et Triton X-100, et

les lysats analysés sur un gel SDS-PAGE. Après autoradiographie, deux bandes radioactives

apparaissent: l’une à 65 kDa et l’autre supérieure à 215 kDa. La bande de 65 kDa indique que

PA (83 kDa) a été clivé par une protéase cellulaire en PA63 (65 kDa); la bande supérieure

suggère la formation d’oligomères de PA ou de PA63. Une expérience similaire utilisant I-

PA63 conduit au même profil, ce qui signifie que la bande supérieure est constituée de PA63.

La cytochalasine D, le chlorure d’ammonium et la monensine font disparaître complètement la

bande supérieure. L’effet de ces agents lysosomotropes suggère donc que la formation

d’oligomères de PA63 dans les cellules requiert une exposition au pH acide. L’ensemble de

ces observations amène à penser que les deux toxines sont actives lorsque PA63 existe sous

forme d’oligomères.

L’oligomérisation de PA63 et son insertion membranaire ont lieu au pH acide qui

provoque une augmentation d’hydrophobicité de PA63. En mesurant la fluorescence du TNS

(toluidinyl-naphthalène sulphonate), Koehler et Collier ont constaté qu’aux pH acides

l’hydrophobicité de PA63 augmente (Figure I. 13) (Koehler et Collier, 1991). En effet,

l’intensité de la fluorescence du TNS est fonction de l’hydrophobité de son environnement.

Une autre approche utilisant le Triton X-114 conduit à la même conclusion (Koehler et

Collier, 1991). A 20°C, le Triton X-114 possède la propriété de former deux phases: une

phase hydrophobe riche en détergent et une phase aqueuse pauvre en détergent. La protéine

présente dans ce système se répartit entre les deux phases selon son hydrophobicité (Bordier,

1981). Pour un pH inférieur à 6, PA63 se trouve toujours dans la phase hydrophobe du Triton

X-114 (Koehler et Collier, 1991).

Lorsque PA63 est mis en présence d’une bicouche lipidique plane au pH acide, il forme

des canaux (Blaustein et al., 1989 ). La bicouche lipidique est formée au niveau d'un orifice

percé dans une mince plaque de Teflon (Mueller et al., 1962). Elle sépare deux compartiments

aqueux dans lesquels plonge une électrode. Pour un potentiel imposé, l’intensité du courant

qui traverse la bicouche lipidique est mesurée, et la conductance de la bicouche peut être

calculée. La présence d’un canal dans cette bicouche lipidique se traduit par une augmentation

de conductance. Le canal de PA63 est perméable aux cations monovalents tels que K^, Na^ et

ions tétraalkylammoniums (Blaustein et al., 1989; Blaustein et Finkelstein, 1990b). Le

a b c

Figure I. 14. Trois modèles de traversée de la membrane intracellulaire par LF et EF

(fragment A), (a) La translocation s’effectue au travers d’un canal formé par PA63

(fragment B) (Finkelstein, 1994). (b) Les deux fragments A et B mettant en contact leurs

régions hydrophiles, alors que leurs régions hydrophobes sont en contact avec les chaînes

acylées des phospholipides (Bisson et Montecucco, 1987). (c) La traversée se fait via un

canal ouvert latéralement formé par PA63 ainsi que décrit pour la traversée de protéines

au travers du réticulum endoplasmique (Martoglio et al., 1995).

Chapitre I: Introduction

diamètre du canal a été estimé à ~12Â (Blaustein et al., 1990). Ce diamètre est proche de celui

de l’heptamère (20Â), ce qui laisse à penser que le canal est constitué d’un heptamère de

PA63. Ces résultats obtenus sur bicouche lipidique plane ont été confirmés sur cellules

eucaryotes: PA63 induit une sortie de ^^Rb"^ intracellulaire (Milne et Collier, 1993) et une

entrée de ^^Na^ dans des cellules CHO incubées à un pH inférieur à 5.5 (Zhao et al., 1995); le

tétrahexyl- et le tétraheptyl- ammoniums capables de bloquer les canaux de PA63 formés dans

des bicouches lipidiques planes (Blaustein et Finkelstein, 1990a) inhibent aussi la sortie de

(Milne et Collier, 1993).

La présence de LF ou EF dans le compartiment cis provoque une diminution de

conductance du canal formé par PA63 (Finkelstein, 1994). Cette observation amène l’auteur à

suggérer que le canal formé par PA63 (B) peut servir d’un conduit pour la translocation de LF

et EF (A) au travers de la membrane lipidique (Finkelstein, 1994) (Figure I. 14a). La taille du

canal est assez grande pour permettre la traversée de LF et EF sous forme déroulée. Dans ce

modèle, la translocation des deux protéines hydrophiles LF et EF leur permet de ne pas rentrer

en contact direct avec les chaînes acylées des phospholipides. Cependant, des expériences de

marquages membranaires réalisées par Kochi et ses collaborateurs (1994) ont montré

clairement l’insertion profonde de LF et de EF dans la membrane lipidique, ce qui est en

contradiction avec ce modèle. Les marqueurs utilisés sont deux analogues radioactifs de la

phosphatidylcholine portant un groupement photoactivable situé soit près de la tête choline

(PCI), soit à l'extrémité d’une chaîne acylée (PCII) (Figure I. 15). Les régions protéiques

localisées près de la surface membranaire sont susceptibles d’être marquées par PCI, et les

régions transmembranaires par PCII (Montecucco et al., 1985). A pH acide, LF et EF sont

marqués par PCI et PCII avec un maximum de marquage à pH 5.5. Le marquage des deux

protéines par PCII indique leur insertion profonde dans la membrane lipidique et leur contact

direct avec les chaînes acylées des phospholipides. Cette observation amène ces auteurs à

penser que la translocation des deux protéines au travers de la membrane pourrait être

semblable au modèle proposé par Bisson et Montecucco (1987) pour la toxine diphthérique

(Figure I. 14b). Dans ce modèle, plusieurs PA63 (B) associés à LF ou EF (A) formeraient un

complexe protégeant les régions hydrophiles des protéines du contact avec la phase

hydrophobe de la membrane lipidique. LF ou EF pourraient alors coulisser le long de PA63

vers le cytoplasme. Le canal de PA63 se formerait après le passage de LF et EF.

Nj

Figure I. 15. Stmcture des analogues de la phosphatidylcholine utilisés pour marquer les

protéines LF et EF dans la membrane des liposomes (d’après Montecucco, 1985). Ces

molécules comportent un groupement nitroarylazide à des profondeurs différentes de la

bicouche lipidique, qui est converti en nitroarylnitrène très réactif sous illumination par un

rayonnement ultraviolet. PCI: l-palmitoyl-2-(-2-azido-4-nitrobenzoyl)-sn-glycéro-3 [^H]-

phosphocholine. PCII : 1 -mirystoyl-2-[-12-amino-(-4-n-3 -nitro-1

-azidophényl)]-dodécanoyl-sn-glycéro-3 [^‘*C]-phosphocholine.

Chapitre I: Introduction

Dans le premier modèle, le canal précède la translocation, alors que dans le second, il

n’apparaît qu’après la translocation. La formation du canal et la translocation des deux

protéines pourraient avoir lieu simultanément. Martoglio et ses collaborateurs (1995) ont

décrit que le canal conduisant les protéines au travers de la membrane du réticulum

endoplasmique était ouvert latéralement vers la bicouche lipidique (Figure I. 14c).

No documento O papel do design na introdução da folha de pedra, para a criação de um novo produto no âmbito da iluminação (páginas 59-90)