Testes Histoquímicos

Foram realizados testes para verificar a presença e localização de lipídios, amido, pectina, lignina, celulose, compostos fenólicos, alcalóides e taninos nas folhas das variedades de crisântemo.

Para todos os testes histoquímicos utilizou-se tecido vegetal fresco, ou seja, sem qualquer tratamento, cortado em micrótomo de mesa com espessura de aproximadamente 20 µm. Os cortes foram colocados em água, procedendo- se as reações conforme descrição de Kraus & Arduim (1997), seguido de observação sob microscópio óptico e de fluorescência de acordo com cada recomendação.

3.1. Compostos graxos

Os testes utilizados para verificação da presença de camada externa às células epidérmicas, composta pela cutina e ceras epicuticulares, além de grânulos de lipídios e gorduras nos interior das células, foram os de Sudam III e Sudam IV.

a. Sudam III

Cortes frescos imersos em álcool 50% foram transferidos para vidros de relógio adicionando o reagente Sudam III por 20 minutos. Posteriormente os cortes foram lavados em álcool 80% e montados em lâmina com glicerina 50% coberta com lamínula, para visualização no microscópio óptico. A coloração observada para presença de compostos graxos deverá ser amarelo-alaranjado.

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Os corte para esta reação foram imersos em álcool 70% seguindo os mesmos procedimentos posteriores executados para reação de Sudam III. A coloração observada para os compostos graxos nesta reação é vermelha, quando positiva.

3.2. Celulose

Em todas as reações para identificação de celulose nos tecidos da folha, os cortes foram transferidos da água para lâmina, posteriormente adicionado o reagente.

a. Lugol-ácido sulfúrico

O teste foi baseado nametodologia empregada por Purvis et al. (1964, p. 152), modificado por Kraus e Arduim, (1997, p.135). Aos cortes frescos foram adicionadas gotas do reagente lugol permanecendo por 5 minutos. Em capela, gotas de ácido sulfúrico 70% foram adicionadas lentamente, observando em seguida o material em microscópio óptico. A reação faz com que as paredes celulósicas tornem-se inchadas e assumam coloração azul brilhante.

b. Cloreto de Zinco iodado

Aos cortes frescos foram adicionadas gotas de cloreto de Zn iodado foram adicionadas, aguardando 1 a 2 minutos. Substituiu-se o reagente por glicerina 50% acrescentada na borda da lamínula, absorvendo com papel de filtro na outra extremidade o cloreto de Zn iodado. Ao observar no microscópio óptico, a coloração assumida pela parte do material com presença de celulose deverá ser azul-acinzentado, lignina de amarelo e amido de cor negra azulada.

3.3. Lignina

Aos cortes foram adicionadas gotas do regente de floroglucinol acidificado nas bordas da lamínula para observação imediata ao microscópio óptico. O tecido lignificado deverá evidenciar a coloração vermelha. O teste de floroglucinol acidificado não é específico, podendo também corar suberina, além da lignina.

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Utilizando os cortes parafinados (item 1.3.) até a etapa precedente à coloração, as lâminas foram imersas em azul de metileno aquoso a 1% por 5 minutos, sendo em seguida lavadas com água destilada 3 vezes por 1 minuto cada. Corou-se em vermelho de rutênio preparado na ocasião (0,02% em água destilada) por 5 minutos. Lavou-se 3 vezes por um minuto. As lâminas foram secas ao ar ou estufa a 40°C, desparafinizadas com xilol duas vezes por 30 minutos cada. As lâminas foram montadas em verniz vitral (Paiva et al. 2006).

3.5. Compostos fenólicos

Foram realizados testes diferentes para verificar a presença de compostos fenólicos, que possivelmente detectam diferentes classes.

a. Dicromatos de Potássio

Este reagente detecta a presença de compostos fenólicos gerais. Os cortes frescos foram mantidos em uma solução aquosa de dicromato de potássio a 10% (Gabe, 1968; Fank-de-Carvalho & Graciano-Ribeiro, 2005) durante 30-60 minutos, lavando em seguida em água, prosseguindo a montagem em glicerina 50% para observação em microscópio óptico. A coloração castanho-avermelhada evidencia a presença de compostos fenólicos.

b. Cloreto de Ferro

O cloreto férrico atua em outras classes de compostos fenólicos, inclusive taninos. Os cortes montados em lâmina com lamínula receberam gotas do reagente nas bordas até o completo preenchimento do espaço sob a lamínula, mantendo por 1 a 2 minutos. O reagente foi substituído por glicerina 50% em água, absorvendo o mesmo com papel de filtro na extremidade oposta a adição da glicerina. A coloração negro-azulada ou verde escura evidencia compostos fenólicos e/ou taninos.

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Para evidenciar os flavonóides através dos fluorocromos sob luz UV foram realizados os testes com acetato de chumbo aquoso a 3% e reagente de Wilson (CHARRIÈRE-LADREIX, 1976; FANK-DE-CARVALHO & GRACIANO- RIBEIRO, 2005). As reações histoquímicas foram analisadas e fotografadas no microscópio Olympus BX-40, equipado com fluorescência.

3.6. Taninos

Para evidenciar taninos, foram realizados teste com vanilina clorídrica 0,5% em ácido clorídrico a 9% (Mace & Howell 1974 apud ASCENSÃO, 2003; FANK-DE-CARVALHO & GRACIANO-RIBEIRO, 2005). Os cortes em água foram transferidos para o reagente permanecendo por 10 minutos, seguido da montagem da lâmina em glicerina 50% em água. Os taninos coram de vermelho.

3.7. Alcalóides

Foram utilizados os reagentes de Dittmar (FURR & MAHLBERG, 1981) e Dragendorff (Svendsen & Verpoorte, 1983, apud ASCENSÃO, 2003) que permite detectar o azoato terciário ou quaternário, não revelando as aminas primárias e secundárias a não ser que esses encontrem-se em concentrações muito elevadas.

a. Dittmar

Os cortes frescos foram colocados diretamente no reagente Dittmar por 5 a 10 minutos, seguido por lavagem em água e montagem em lâmina com água glicerinada 50%, cobertos por lamínula. Os alcalóides são grânulos castanho-avermelhados.

b. Dragendorff

Os cortes do tecido vegetal fresco em água foram transferidos para o reagente Dragendorff e mantidos por 5 a 10 minutos, seguido de lavagem rápida em nitrito de sódio a 5%, e posteriormente em água e em seguida

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deverão corar de castanho-avermelhado.

4. Avaliação

Os testes histoquímicos foram visuais e adotou-se uma escala considerando a intensidade da reação, sendo: (-) ausência da reação típica do teste; (+) reação presente em pequenas porções ou partes da estrutura anatômica ou em células isoladas do tecido considerado; (+) reação presente em grupos de duas a quatro células contíguas no tecido analisado; (++) reação presente em cinco ou mais células contíguas no tecido analisado.

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