3. Material e Métodos
3.2. Tipagem capsular de Hi
3.2.2. Tipagem capsular pela PCR
Para a padronização e a realização dos ensaios da PCR, foram observadas as normas de boas práticas de laboratório em biologia molecular tais como utilização de local adequado para a manipulação das amostras, uso de luvas, pipetadores, ponteiras e tubos apropriados com o propósito de evitar contaminações.
3.2.2.1 Extração do DNA bacteriano
A PCR foi padronizada na Seção de Bacteriologia do IAL, utilizando-se o DNA extraído das mesmas cepas padrões utilizadas para controle de qualidade dos antissoros nos ensaios de SAg neste estudo.
A suspensão de DNA extraído de cada cepa foi preparada transferindo 4 a 6 colônias da cepa teste para 60 µL de solução salina estéril. Esta suspensão foi fervida por 10 minutos e centrifugada (Marathon 26krm, Fischer Scientific) a 1.300 rpm por 3-5 minutos. O sobrenadante foi estocado a –20 °C.
3.2.2.2 Amplificação dos iniciadores
A PCR foi realizada pelo emprego de iniciadores (HI-I e HI-II, HI-IV e HI-V, a1 e a2, b1 e b2, c1 e c2, d1 e d2, e1 e e2, f1 e f2) (Tabela 1) sintetizados com base em seqüências de DNA para o gene bexA (gene para a expressão capsular), que distingue cepas de Hi entre capsuladas e NC, e para os genes que codificam os seis sorotipos capsulares (Falla et al.,1994).
Iniciadores derivados da seqüência do gene p6 (gene para a expressão da proteína P6), presente em todas as cepas de Hi também foram utilizados, para controle da reação da PCR (Van Ketel et al., 1990).
Uma segunda etapa da PCR, usando como molde o produto da primeira reação em uma diluição 1:1000, foi necessária para a confirmação deste. Para isto, um terceiro iniciador interno (a3, b3, c3, d3, e3, f3) (Tabela 1) e um dos iniciadores referentes à primeira reação foram utilizados sob as mesmas condições da etapa anterior. (Falla et al., 1994).
O volume final para a PCR foi 25 µL, contendo deoxiribonucleotideos (200 µM) [Gibco BRL Life Technologies (Gibco)], iniciadores (1 µM cada) (Gibco), tampão da reação (Gibco) e 0,5 U de Taq Polimerase (Gibco). Um volume de 1 µL de suspensão de DNA foi usado como molde. As amostras e o controle negativo, preparados com água ultrapura estéril, foram incubados no termociclador (GeneAmp PCR System 9600, Perkin-Elmer, Norwalk, CT, EUA) e submetidos a 25 ciclos (primeira etapa) ou 15 ciclos (segunda etapa) contendo 1 minuto de desnaturação a 94°C, 1 minuto de anelamento a 55°C e 1 minuto de extensão a 72°C. Após o último ciclo, todas as amostras foram submetidas a 72°C p or 10 minutos.
Após o término da reação as amostras foram incubadas a 4°C no aguardo da eletroforese em gel de agarose dos produtos amplificados.
Tabela 1. Iniciadores utilizados na tipagem capsular de Haemophilus influenzae.
Função / Gene Iniciador Seqüência de nucleotideos (5' - 3')
Produto bexA HI – I * CGTTTGTATGAGTTGATCCAGACT
Presença de cápsula
HI – II * TGTCCATGTCTTCAAAATGATG 343
-
* iniciadores da primeira etapa da PCR
** iniciadores da segunda etapa da PCR (Van Ketel et al., 1990: Falla et al, 1994)
3.2.2.3. Verificação da presença do produto de amplificação.
Um volume de 15 µL de cada produto de amplificado foi homogeneizado com 5,0 µL de solução de arraste e submetido à eletroforese em gel de agarose (Sigma) a 1,0 % em TBE 1X durante uma hora a 100 volts. Foi usado como padrão de peso molecular, um marcador de DNA de 100 pares de base (pb) (Gibco). A eletroforese foi realizada em cuba horizontal (Sigma) utilizando-se a fonte EPS 200 (Pharmacia Biotech).
Após a eletroforese dos produtos amplificados, o gel foi corado com brometo de etídio a uma concentração de 0,4 µg/mL por 30 minutos e examinado sobre uma fonte de luz ultravioleta com comprimento de onda de 254 nm (Pharmacia Biotech). O gel foi fotografado com a máquina Polaroid modelo MP-4 Land (Polaroid Corporation, Cambridge, MA, EUA), filme 667 (Polaroid) e filtro laranja (Kodak, Eastman Chemical, New Haven, EUA).
3.2.2.4 Interpretação da tipagem capsular pela PCR
A tipagem capsular foi considerada positiva quando ocorreu a amplificação de DNA do gene bexA e de um dos genes específicos para cápsula; a cepa foi tipada como mutante deficiente para a expressão capsular quando resultou em ausência de amplificação do gene bexA e positiva para o gene capsular específico cap b e tipada como NC quando da ausência de amplificação para os gene bexA e para o gene específico de cápsula (Falla et al.,1994). Todas as cepas testadas foram confirmadas como pertencentes a espécie Hi através da amplificação do gene p6 (Van Ketel et al., 1990).
3.3. Análise dos dados
Os resultados obtidos pela SAg método 1, SAg método 2 e PCR foram tabulados e posteriormente analisados separadamente para os isolados Inv e Col. A frequência dos tipos capsulares e seus respectivos intervalos de confiança (CI95%) foram estimados para cada metodologia.
Diferenças nos resultados de frequência entre as metodologias foram consideradas significantes quando não ocorreu sobreposição do CI95%. A reação de PCR foi considerada como método de referência nesta proposta de comparação. A porcentagem de concordância entre os resultados de um determinado método de SAg e a PCR foi calculada pelo número de cepas com resultados de SAg e PCR concordantes para um determinado tipo capsular no numerador, dividido pelo número total de cepas com o resultado do respectivo tipo capsular obtidos pelo método de SAg em questão. As taxas de concordância foram calculadas separadamente para os grupos de cepas Inv e Col. Os resultados de cepas NC pela SAg com correspondente tipo mutante capsular b- obtidos pela PCR, isto é, perda do gene para a expressão capsular (Kroll et al.1990) foram considerados concordantes. Os valores de acurácia [sensibilidade (S), especificidade (E)]
dos métodos de SAg comparados com a PCR paras as cepas Inv e Col também foram calculados (Fletcher et al., 1996). As cepas poliaglutinantes e autoaglutinantes foram excluídas dos cálculos de acurácia e taxa de concordância por não fornecerem resultados comparativos.
Para avaliar o desempenho do antissoro polivalente na SAg, os resultados obtidos com o teste presuntivo foram comparados com os respectivos resultados da SAg método 2.
3.4. Algoritimo de tipagem capsular de Hi padronizado no IAL para utilização na rotina diagnóstica da vigilância epidemiológica
A partir do ano de 2003 foi introduzido na rotina diagnóstica da vigilância epidemiológica no IAL um algoritimo para tipagem capsular de Hi, fruto dos resultados da primeira parte deste estudo, isto é, após avaliação da acurácia da SAg. As 180 cepas (145 Inv e 35 Col) de Hi recebidas pelo IAL no biênio 2003-2004 foram tipadas seguindo este algoritimo. Estas cepas foram encaminhadas pelos laboratórios das regiões Sudeste (69,7%) Nordeste (13,8%), Centro-Oeste (5,9%) e Sul (10,6%) do país.
Todas as cepas provenientes de uma única colônia isolada foram submetidas a SAg método 2. Os mesmos critérios de interpretação das reações de aglutinação referentes ao estudo da acurácia da SAg foram utilizados. Desta forma, reações de aglutinação fortes (+++ ou ++++) com um único antissoro conferiram às respectivas cepas um resultado final de tipo capsular. Cepas com resultados duvidosos pela SAg método 2 (autoaglutinantes, poliaglutinantes ou com reações fracas), e as cepas tipadas como NC, foram, posteriomente, testadas pela técnica da PCR para elucidação do tipo capsular e identificação de possíveis cepas mutantes deficientes para a expressão de cápsula (cepas b-).
4. Resultados
4.1. Padronização da PCR para tipagem capsular de Hi
A técnica da PCR utilizada para tipagem capsular de Hi foi padronizada no IAL a partir do DNA das cepas padrão para os seis sorotipos capsulares, conforme mostra a figura 3.
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Figura 3. Eletroforese em gel de agarose 1% do produto da PCR para tipagem capsular de Haemophilus influenzae amplificado a partir dos iniciadores derivados das seqüências dos genes para confirmação de espécie (gene p6), presença de cápsula (gene bexA) e tipo capsular (locus cap). Linha 1. peso molecular padrão de 100pb; Linha 2. gene p6 (273pb);
Linha 3. gene bexA (343 pb); Linha 4. cap a (250pb); Linha 5. cap b (480pb); Linha 6. cap c (250pb); Linha 7. cap d (150pb); Linha 8. cap e (1350pb); Linha 9. cap f (450pb).
1500pb
600pb
100 pb
4.2. Estudo da acurácia da SAg
A freqüência dos tipos capsulares de cepas Inv de Hi estudadas pelas três metodologias está apresentada na Tabela 2. Diferenças significativas nas taxas de freqüência foram encontradas para o tipo capsular b, entre o SAg método 1 [12,1% (CI95%: 7,4-18,7)] e PCR [29,8% (CI95%:
22,4-38,0)], e para cepas não capsuladas (NC) pelo SAg método 1 [52,0%
(CI95%: 43,3-60,4)] e PCR [28,3% (CI95%: 21,0-36,4)]. Entretanto, não foi verificada diferença estatística para o tipo b pelo SAg método 2 e PCR.
Cepas do sorotipo a, c, d, e, e f, foram identificadas em freqüências iguais ou similares pelas três metodologias. Três cepas mostraram reação de poliaglutinação quando testadas pelo SAg método 2, sendo caracterizadas como NC (n=2) e tipo b (n=1) pelo SAg método 1 e PCR. A técnica de PCR identificou 4 cepas pertencentes ao tipo capsular b-, que foram sorotipadas corretamente como NC pelos dois métodos de SAg. Nenhuma reação de autoaglutinação foi identificada entre cepas Inv.
As taxas de concordância para as cepas Inv entre SAg métodos 1 e 2 comparados com a PCR foram de 68,0% e 88,3%, respectivamente (Tabela 2). Desta forma, um aumento de 20,3% de concordância foi observado quando o SAg método 2 foi aplicada. Foi detectada uma taxa baixa de concordância entre as cepas NC. Somente 47% das cepas NC identificadas pelo SAg método 1 e 71% pelo método 2 foram confirmadas por PCR. Essas cepas falsamente identificadas como NC pelo SAg método 1 foram caracterizadas como sendo do tipo a (n=9), b (n=22) e f (n=1) por PCR, enquanto as cepas falso NC identificadas pelo método 2 foram tipadas como a (n=2) e b (n=9) por PCR. A análise da intensidade das reações de aglutinação para este grupo de cepas mostrou reações fracas (+, ++), as quais contribuíram para perda da correta identificação do sorotipo. Cepas capsuladas não pertencentes ao sorotipo b apresentaram taxas de concordância que variaram de 80% a 100% entre os métodos de SAg e PCR, com exceção de duas cepas sorotipadas como d pelo SAg método 1, as quais foram tipadas como d e NC por PCR.
Tabela 2. Comparação das freqüências do tipo capsular de 131 cepas invasivas de Haemophilus influenzae pertencentes ao banco de cepas do IAL (1985 – 2002) e caracterizados pela SAg, métodos 1 e 2, e pela PCR.
Freqüência do tipo capsular Concordância com PCR Tipo capsular
f 4 cepas identificadas como b- por PCR e como NC pelo SAg método 1 foram consideradas concordantes.
g 4 cepas identificadas como b- por PCR e como NC pelo SAg método 2 foram consideradas concordantes
h P: 3 cepas identificadas como NC (n=2) e tipo b (n=1) por PCR
i 3 cepas poliaglutinantes foram excluídas para o cálculo da taxa de concordância
As taxas de freqüência dos tipos capsulares para cepas Col estão na Tabela 3. As porcentagens de freqüência do tipo b foram significativamente diferentes entre SAg método 1 [41,0% (CI95%: 32,6-49,6)] e SAg método 2 [2,3% (CI95%: 0,6-6,3)], e entre SAg método 1 [41,0% (CI95%: 32,6-49,6)] e PCR [2,3% (CI95%: 0,6-6,3)]. Porcentagens diferentes foram encontradas entre as cepas NC pelo SAg método 1 [41,0% (CI95%: 32,6-49,6)], comparadas com o método 2 [86,0% (CI95%: 78,9-91,1)] e com a PCR [93,0%
(CI95%: 87,4-96,5)]. Sorotipos a, c, d, e e f foram identificados com baixa freqüência ou não foram identificados, dependendo do método utilizado. Três cepas poliaglutinantes e três autoaglutinantes foram identificadas pela SAg método 2, as quais foram tipadas como NC por PCR. Entre as cepas Col, nenhuma foi identificada como b- pela PCR.
As taxas de concordância dos tipos capsulares de Hi para cepas Col por SAg métodos 1 e 2 comparadas com PCR foram de 46,5% e 94,2%, respectivamente (Tabela 3). Portanto, um incremento de 47,7% nesta porcentagem de concordância foi obtido quando o SAg método 2 foi empregada. A comparação dos resultados obtidos pela SAg método 1 e PCR mostrou que todas as 52 cepas sorotipadas como NC e as duas cepas sorotipadas como tipo e foram confirmadas pela PCR. Entretanto, 68 cepas sorotipadas equivocadamente pelo SAg método 1 resultou em uma taxa baixa de concordância, que variou de 0 a 27,3%. Entre estes resultados, a maior discrepância foi a ocorrência de 50 cepas falsamente sorotipadas como b pelo SAg método 1; por PCR, 49 dessas cepas foram identificadas como NC e uma cepa como tipo a. Cepas erroneamente sorotipadas como a (n=4), c (n=3), d (n=3) e f (n=8) foram tipadas como NC (n= 17) e tipo b (n=1) por PCR. A intensidade da reação de aglutinação destas 50 cepas falso-sorotipo b realizada pela SAg método 1 revelou reações fracas (+, ++) para a maioria das cepas. Quando os resultados da SAg método 2 e PCR foram comparados, somente 7 resultados discrepantes ocorreram, especificamente, sorotipos a (n=2), b (n=1), c (n=2) e NC (n=2), os quais foram tipados como NC (n=5), tipo b (n=1) e e (n=1) por PCR (Tabela 3).
Tabela 3. Comparação das freqüências do tipo capsular de 127 cepas de Haemophilus influenzae provenientes de portadores e pertencentes ao banco de cepas do IAL (2000 – 2002) caracterizados pela SAg, métodos 1 e 2, e pela PCR.
Freqüência do tipo capsular Concordância com a PCR Tipo capsular
d P: 3 cepas identificadas como NC por PCR
e NA: não aplicado
f A: 3 cepas identificadas como NC por PCR
g 6 cepas (poliaglutinantes e autoaglutinantes) foram excluídas para o cálculo da taxa de concordância
A análise da intensidade das reações de aglutinação mostrou que 11,0% das cepas Inv e 14% das cepas Col apresentaram um certo grau de reação inespecífica. Em geral, aglutinações positivas entre cepas Inv apresentaram grumos grandes (+++, ++++) enquanto que cepas Col apresentaram um padrão de aglutinação com menor definição.
Os valores da acurácia dos métodos de SAg comparados com a PCR para a população de Hi Inv e Hi Col estão na Tabela 4. A SAg método 1 para cepas Col mostrou-se o método mais sensível (S = 100%), entretanto também apresentou a menor especificidade (E = 43%) com 53,5% de resultados falso positivos. Neste estudo, observou-se também que o teste de SAg método 2 demonstrou ser mais específico que a SAg método 1, tanto para cepas Inv como para cepas Col, o primeiro apresentando valores de especificidade para cepas Inv e Col de 90,2% e 95,5%, respectivamente, enquanto os valores de especificidade do teste de SAg método 1 foram de 78,3% para cepas Inv e 43,3% para cepas Col.
Tabela 4. Acurácia (%) da SAg métodos 1 e 2 comparados com a PCR entre as cepas de Haemophilus influenzae invasivas (1985 – 2002) e de portadores (2001 – 2002) pertencentes ao banco de cepas do IAL.
a SAg método 1: antissoro b como triagem
b SAg método 2: todos os antissoros em paralelo Acurácia (%)
SAg método 1a versus PCR
SAg método 2 b versus PCR
Hi Inv Hi Col Hi Inv Hi Col
Sensibilidade 62,3 100 86,2 77,8
Especificidade 78,3 43,3 90,2 95,5
Concordância 68,0 46,5 88,3 94,2
Resultado Falso + 24,4 53,5 8,6 1,7
Resultado Falso - 7,6 0 3,1 4,1
4.3. Avaliação do antissoro polivalente de Hi como reagente do teste presuntivo para a SAg.
A avaliação do resultado do teste presuntivo com o antissoro polivalente comparado com o respectivo SAg método 2 detectou uma porcentagem de concordância de 72,6% (CI95%: 59,5-82,8); 8,0% (CI95%:
3,0-18,5) das cepas apresentaram aglutinação falso-positiva e 19,3%
(CI95%: 10,8-31,7) apresentaram aglutinação falso-negativa neste teste presuntivo. Nessa avaliação, não se observou diferença entre as cepas Inv e Col.
4.4. Algoritimo de tipagem capsular estabelecido no IAL para uso na rotina diagnóstica da vigilância epidemiológica do Hi.
Após o estudo da SAg, foi proposto um algoritimo de tipagem capsular de Hi consistindo da SAg método 2 complementada pela PCR para uso na rotina diagnóstica da vigilância epidemiológica do Hi (Figura 4).
Cepas com resultados inconclusivos Cepas não capsuladas Soroaglutinação método 2
Haemophilus influenzae
Ausência de amplificação
Presença de amplificação
Cepa não capsulada
PCR paralocus cap b
Ausência de amplificação
Presença de amplificação
Haemophilus influenzae não capsulado
Haemophilus influenzae mutante deficiente para expressão de cápsula (b-)
Haemophilus influenzae tipo capsular ( a, b, c, d, e, f)
PCR para locus capa, b, c, d, e, f
Presença de amplificação
Haemophilus influenzae tipo capsular ( a, b, c, d, e, f)
Figura 4. Algoritmo de tipagem capsular estabelecido no IAL para uso da rotina diagnóstica da vigilância epidemiológica do Haemophilus influenzae.
Cepas capsuladas
PCR para gene bexA
43
4.5. Resultados obtidos pelo uso do algoritimo de tipagem capsular de Hi durante a rotina diagnóstica da vigilância epidemiológica no biênio 2003-2004.
O algoritimo de tipagem capsular de Hi foi introduzido na rotina diagnóstica da vigilância epidemiológica no IAL no ano de 2003. O presente estudo mostra os resultados obtidos pelo uso deste no biênio 2003-2004.
Todas as 180 cepas (145 Inv e 35 Col) de Hi recebidas pelo IAl foram tipadas segundo este algoritimo.
Entre as 145 cepas Inv, a SAg método 2 identificou os sorotipos capsulares de 126 cepas (86,9%), a citar, sorotipos a (n=27, 21,4%), b (n=64, 50,8%), c (n=1, 0,8%), d (n=2, 1,6%), e (n=1, 0,8%), f (n=3, 2,4%) e NC (n=28, 22,2%) (Tabela 5). Entre as 35 cepas Col, a SAg método 2 identificou os sorotipos de cepas pertencentes ao sorotipos b (n=1, 2,8%) e e (n=1, 2,8%), além de identificar 30 cepas como NC (85,7%). Portanto, 3 cepas Col não puderam ser sorotipadas por este método (8,6%), sendo uma cepa autoaglutinante e 2 cepas com aglutinações inespecíficas. Pela PCR, estas 3 cepas resultaram em cepas NC e as 30 cepas sorotipadas como NC pela SAg receberam a confirmação deste resultado pela PCR.
Tabela 5. Freqüência dos tipos capsulares de Haemophilus influenzae obtidos pela SAg método 2 de 126 cepas invasivas e 32 cepas de portadores provenientes da rotina diagnóstica da vigilância epidemiológica no biênio 2003 – 2004.
Tipo capsular de
SAg método 2* (Inv)
SAg método 2* (Col)
H. influenzae N° (%) N° (%)
a 27 (21,4) 0 (0)
b 64 (50,8) 1 (2,8)
c 1 (0,8) 0 (0)
d 2 (1,6) 0 (0)
e 1 (0,8) 1 (2,8)
f 3 (2,4) 0 (0)
NC 28 (22,2) 30 (85,7)
Total 126 (100) 32 (100)
*
SAg método 2: todos os antissoros em paralelo.
As 19 cepas (13,1%) cujos resultados de tipagem capsular não puderam ser concluídos pela SAg método 2 e as 28 cepas identificadas como NC por este método foram tipadas pela PCR (Tabela 6). Observa-se que entre as cepas que tiveram resultados inconclusivos, uma cepa autoaglutinante pela SAg método 2 foi identificada como NC pela PCR; 7 cepas apresentaram reações poliaglutinantes sendo identificadas como NC (n=3) e b (n=4) pela PCR; 11 cepas com aglutinações fracas ou inespecíficas foram identificadas como NC (n=9), a (n=1) e b (n=1) pela PCR. As cepas NC foram responsáveis por 68,4% dos resultados inconclusivos pela SAg método 2, seguidas de cepas do sorotipos b (26,3%) e a (5,3%). Todas as 28 cepas Inv identificadas como NC pela SAg método 2, com exceção de uma, receberam a confirmação do tipo capsular NC pela PCR e o resultado discrepante foi identificado como tipo capsular b por PCR.
Nenhuma cepa foi tipada como mutante deficiente para a expressão de cápsula entre as cepas isoladas no biênio 2003-2004.
Tabela 6. Comparação dos resultados de tipagem capsular entre as técnicas de SAg método 2 e PCR de 47 cepas invasivas de Haemophilus influenzae provenientes da rotina diagnóstica da vigilância epidemiológica no biênio 2003 – 2004.
Tipo capsular pela PCR Sorotipagem
pela SAg método 2* a b c d e f NC Total
Autoaglutinação - - - 1 1
Poliaglutinação - 4 - - - - 3 7
Reação inespecífica 1 1 - - - - 9 11
NC 0 1 - - - - 27 28
Total 1 6 - - - - 40 47
*SAg método 2: todos os antissoros em paralelo.
5. Discussão
A implantação da vacina conjugada de Hib fez surgir um novo cenário epidemiológico das doenças causadas por Hi. A identificação correta do polissacáride capsular deste organismo é fundamental para monitorar as mudanças na prevalência dos sorotipos de Hi e para estimar com acurácia o impacto da vacina ao longo dos anos.
Experiências recentes com problemas na identificação do sorotipo de Hi pela SAg no IAL, somados a relatos similares na literatura, levou-nos a avaliar a acurácia da SAg pelo estudo de uma amostragem de cepas significativas e sua utilidade no período após a implantação da vacina. A escolha da técnica da PCR para fins de comparação com a SAg neste estudo é justificada pela boa acurácia, reprodutibilidade e facilidade de execução (Van Ketel et al., 1990; Falla et al., 1994).
Os resultados do estudo da acurácia da SAg demontraram as limitações desta técnica na identificação dos tipos capsulares de Hi quando comparada com os resultados obtidos pela PCR. A maioria dos resultados discrepantes foi resultante de aglutinações não específicas ou reações cruzadas entre os antissoros sorotipo específicos. Portanto, perda de correta identificação dos sorotipos pode ocorrer quando a SAg não é apropriadamente aplicada. subestimou, em aproximadamente 18,0%, a prevalência do sorotipo b entre cepas invasivas. Por outro lado, entre as cepas de portadores, o uso da SAg método 1 superestimou a prevalência do sorotipo b em aproximadamente 39,0%. Estas cepas sorotipo b foram identificadas como NC pela PCR, o que explica a baixa concordância entre a SAg método 1 e PCR (3,8%). Portanto, a maioria dos resultados discrepantes encontrados pela SAg método 1
envolveu cepas NC e cepas pertencentes ao sorotipo b. Entretanto, o emprego de todos os antissoros em paralelo (SAg método 2) aumentou significativamente a concordância entre os resultados de sorotipos comparados com os resultados obtidos pela PCR, para ambas as cepas invasivas e de portadores, em aproximadamente 20,0% e 48,0%, respectivamente.
De fato, a SAg método 2 tem a vantagem visual de mostrar os padrão de aglutinação com os seis antissoros específicos ao mesmo tempo, tornando a interpretação do resultado de sorotipagem mais fácil e direta. A pequena proporção de sorotipos incorretos com o emprego da SAg método 2 pode estar relacionada às características individuais das cepas quanto a expressão da cápsula e/ou outros antígenos de superfície da bactéria (Gilsdorf, 1998). Os antissoros utilizados para a sorotipagem do Hib são policlonais, portanto é composto de anticorpos contra várias frações antigênicas da bactéria, polissacarídicas e protéicas, podendo ocorrer aglutinações não específicas ou reações cruzadas (Kilian, 2003).
O uso do antissoro polivalente como reagente presuntivo na SAg mostrou baixo poder discriminatório (S= 65,8% e E= 91,7%) com uma taxa de concordância de aproximadamente 76%. Outros trabalhos também reportam resultados similares (Shively, 1981).
Em um estudo recentemente publicado sobre discrepâncias na sorotipagem de Hi entre cepas invasivas, os autores descrevem que o principal erro foi a subavaliação de cepas NC, as quais incluíam cepas sorotipo b falso-positivas (LaClaire et al., 2003). Este resultado impreciso foi atribuído ao uso do antissoro b como triagem, levando a considerar qualquer forma de aglutinação como reação positiva para Hib (LaClaire et al., 2003).
No presente estudo, a intensidade fraca de aglutinação explica o resultado das 50 cepas de portador sorotipo b falso-positivas pelo SAg método 1.
Nossa observação de que cepas de Hi de nasofaringe são mais difíceis de serem sorotipadas, quando comparadas com as cepas invasivas, baseia-se no fato de que cepas NC, prevalentes em portadores, apresentam uma maior diversidade de antígenos na superfície bacteriana. Também, a
produção relativamente menor de polissacarídeo capsular entre as cepas capsuladas isoladas de portador (Gilsdorf, 1998; Murphy e Apicela, 1987;
Ogilvie, 2001) poderia explicar o maior número de aglutinações não específicas entre estas cepas.
Outro ponto importante observado neste estudo relaciona-se com
Outro ponto importante observado neste estudo relaciona-se com