Os métodos de tipificação são baseados na teoria de que os isolados de P. multocida que apresentam uma fonte comum de isolamento compartilham propriedades que os diferenciam de cepas de outras origens (BLACKALL; MIFLIN, 2000). Os métodos são utilizados para a caracterização detalhada sobre a diversidade das cepas e em estudos de patogenia e de epidemiologia (BOERLIN et al., 2000; KARDOS; KISS, 2005). A tipificação molecular pode ser utilizada para a identificação da fonte de infecção em casos de surtos de doenças (BRUISTEN; SCHOULS, 2010).
Estes testes são geralmente avaliados quanto à tipabilidade, à reprodutibilidade, ao poder de discriminação e quanto à facilidade de uso (ARBEIT, 1995). Se o poder discriminatório for adequado, o método pode ser utilizado para a coleta de dados sobre certos membros da população bacteriana e para relacioná-los com a doença e com os hospedeiros (CHRISTENSEN; BISGAARD, 2006). Contudo, a relação filogenética predita através da comparação do polimorfismo de nucleotídeos em posições conservadas dos nove genomas de P. multocida sequenciados demonstra que não há correlação das relações filogenéticas das cepas conforme o país de isolamento, o sorogrupo, a doença e a predileção por um determinado hospedeiro (BOYCE et al., 2012).
Os métodos moleculares apresentam maior destaque na tipificação de P. multocida devido às limitações inerentes aos testes de biotipificação através da fermentação de carboidratos (MUHAIRWA et al., 2001) e através dos testes
sorológicos (CARTER, 1955; CARTER, 1961). Além disto, geralmente a biotificação e os métodos sorológicos não apresentam poder discriminatório suficiente para a análise de surtos distintos causados por um mesmo clone de P. multocida (CHRISTENSEN; BISGAARD, 2006). Também a tipificação molecular dos sorogrupos de P. multocida representa uma ferramenta útil na comparação de cepas, especialmente de origens distintas. Entretanto, ela se torna ineficaz na diferenciação e na caracterização dos isolados em geral (DAVIES; MACCORQUODALE; REILLY, 2004).
Atualmente, diferentes métodos de genotipagem são empregados em estudos epidemiológicos (DZIVA et al., 2008). A análise de enzima de restrição (Restriction endonuclease analysis - REA), a ribotipagem, a análise do polimorfismo de DNA amplificado ao acaso (Random Amplification of Polymorphic DNA - RAPD), a sequência palindrômica repetitiva (Repetitive Extragenic Palindromic - REP-PCR), a análise do polimorfismo no comprimento de fragmentos de restrição (Restriction Fragment Length Polymorphism – PCR-RFLP), a eletroforese enzimática multilocus (Multilocus Enzyme Electrophoresis - MLEE) e a tipificação por sequenciamento de multilocus (Multilocus Sequence Typing - MLST) são as técnicas mais utilizadas (PEDERSEN et al., 2003; DAVIES; MACCORQUODALE; REILLY, 2004; DZIVA et al., 2004; JABBARI; ESMAELIZADEH, 2005; SHIVACHANDRA; KUMAR; CHAUDHURI, 2008; SINGH et al., 2013; PETERSEN et al., 2014). Entretanto, nenhuma das técnicas citadas é considerada um padrão ouro para a tipificação de P. multocida (LEOTTA et al., 2006a).
Estas técnicas são fundamentais na discriminação de surtos de CA, pois as cepas de P. multocida de origem aviária apresentam grande diversidade molecular, constatada por inúmeros estudos (GUNAWARDANA; TOWNSEND; FROST, 2000; PETERSEN et al., 2001; DAVIES; MACCORQUODALE; CAFFREY, 2003b). Por exemplo, 56 tipos eletroforéticos foram identificados entre 81 isolados autralianos de CA através da técnica de MLEE (BLACKALL et al., 1998). Em 2000, Gunawardana, Townsend e Frost analisaram 73 cepas australianas e 22 vietnamitas de P. multocida de origem aviária através de eletroforese em campo pulsado (Pulsed-Field Gel Electrophoresis - PFGE) com alto poder de discriminação. Outras pesquisas com cepas isoladas de hospedeiros distintos e baseadas especialmente no trabalho de Gunawardana, Townsend e Frost (2000) foram realizadas nos últimos anos (JAGLIC et al., 2005; JAGLIC et al., 2006; LEOTTA et al., 2006b; ANTONY et al., 2007; FERREIRA et al., 2012).
Da mesma forma, o uso de REA e da ribotipagem têm provido consideráveis informações sobre as características genômicas de P. multocida (WEISER et al., 2003; DZIVA et al., 2004). Através do emprego da ribotipagem, Christensen, Dietz e Bisgaard (1998) observaram que os surtos ocorridos em aves aquáticas e domésticas na Dinamarca em 1996 foram causados pelo mesmo clone de P. multocida. Contudo, tanto a REA quanto a ribotipagem são técnicas laboriosas (JABBARI; ESMAELIZADEH, 2005).
Assim, entre os métodos moleculares disponíveis, os testes de caracterização genômica relacionados ao uso de PCR são mais rápidos, viáveis e precisos (JABBARI; ESMAELIZADEH, 2005). Um exemplo é a técnica de PCR-RFLP, na qual fragmentos amplificados por PCR são submetidos à digestão com uma ou mais endonucleases de restrição, seguida de eletroforese em gel de agarose (GANDRA et al., 2008). A RFLP é utilizada na verificação de polimorfismos a partir da identificação da alteração do padrão de clivagem associado a mutações pontuais em sítios específicos de restrição (PASSAGLIA; ZAHA, 2003). Pesquisas baseadas nas estruturas do gene ompH e do lipopolissacarídeo são alguns exemplos de trabalhos que utilizaram a técnica de PCR- RFLP em P. multocida (BOROWSKI, 2001; JABBARI; ESMAELIZADEH, 2005; TSAI et al., 2011; SELLYEI; IVANICS; MAGYAR, 2013; GHANIZADEH et al., 2015).
Entre 20 a 30% dos genes presentes em uma bactéria codificam OMPs que, em parte, estão sujeitas à pressão seletiva e à considerável heterogeneidade na massa molecular e na sequência nucleotídica que podem ser utilizadas para avaliar a diversidade e as relações epidemiológicas das cepas (DAVIES; MACCORQUODALE; REILLY, 2004). A proteína OmpH consiste na principal OMP presente no envelope de P. multocida e o alinhamento genético dos 16 sorotipos existentes demonstra variação no comprimento e na sequência nucleotídica restrita a duas regiões que codificam grandes alças presentes na estrutura secundária da proteína (HATFALUDI et al., 2010).
Outra importante porina é a OmpA, contudo esta proteína apresenta menor heterogeneidade do que OmpH (DAVIES; MACCORQUODALE; CAFFREY, 2003b). Em 2015, Voudigou e colaboradores observaram a presença de três diferentes perfis entre cepas de bovinos e de suínos, na Grécia, utilizando a mesma enzima DraI e outra região do gene ompA amplificada. As proteínas inseridas na membrana externa de bactérias Gram-negativas apresentam funções diversas e essenciais para a célula bacteriana, como a interação do patógeno com o ambiente ou com os tecidos do
hospedeiro, além de promoverem o transporte de moléculas (HATFALUDI et al., 2010).