Ion Torrent

A maioria dos sequenciadores utiliza uma DNA polimerase para gerar a fita complementar ao template, bases marcadas por fluoroforos, e câmeras a detecção. O Ion Torrent é diferente pois a detecção é feita diretamente. A reação de polimerização gera naturalmente um um H+3, ou seja, um próton, que altera o pH do meio. Essa alteração do pH é detectada por um transistor ISFET[1] e convertida em um sinal elétrico (figura 1.3).

Figura 1.3: Reação de incorporação de uma base pela polimerase.

Outro ponto importante para determinar a sequência é sincronizar a polimerase com a detecção, tanto no Ion Torrent quanto no 454 essa sincronização é feita pelo controle do tipo disponível para a polimerase. Por exemplo, suponha que o início do fragmento que se deseja sequenciar seja AGT e que o sequenciador disponiblize uma certa quantidade de dTTP. A polimerase vai fazer o pareamento do A com o T e o sinal vai ser detectado pelo transitor ISFET. Para continuar a reação, a polimerase necessita de um dCTP, porém esse reagente não está disponível e, portanto, a reação para e a leitura da incorporação é feita. Em seguida, ocorre uma lavagem, e a base seguinte é injetada, e assim por diante em uma série 3A reação de polimerização também gerar um fosfato e esse é o caminho de deteção utilizado pelo 454, com a diferença que a emissão do fosfato não é detectada diretamente, mas indiretamente através da ativação de uma luciferase que gera luz de fluxos. Podemos ver na figura 1.4 uma representação dos sinais detectados pelo sensor de um único poço. É essa informação de intensidade de sinal que é convertida depois na sequência de bases.

Figura 1.4: Flowgram da sequência AATCTTCGT...

Uma questão relevante para os sequenciadores que utilizam fluxos de dNTP’s são os homopolímeros, sequencias contínuas de bases iguais como AAAA, CCCCC e etc4. Nesse caso, todas as bases do homopolímero vão ser incorporadas em um único fluxo. Felizmente, o sensor ISFET tem uma resposta bastante linear; portanto, se um A tem um sinal x, um AA vai ter um sinal aproximadamente 2x, e assim por diante. Na prática, é possível detectar com boa acurácia homopolímeros de até 6 bases. O último elemento importante, e que diferencia os sequenciadores da nova geração em relação à anterior, é o paralelismo da reação e da detecção. No Ion Torrent esse paralelismo é obtido pelo uso de chips de silício. Utilizando o processo CMOS, o mesmo utilizado na fabricação de chips de computador ou sensores de câmeras digitais, são construídos milhões de poços microscópicos um pouco maiores do que as esferas com fragmentos de DNA, de forma que, em cada poço, tenha somente uma esfera. No chip estão também os transitores IsFET que fazem a detecção da mudança de pH, ou seja, cada poço possui o seu próprio “pH-gâmero” para fazer a detecção do sinal[29].

2.6. SOLiD

A sigla SOLiD significa Sequencing by Ligation and Detection e descreve bem o processo de sequenciamento utilizado pelo instrumento. Ao invés de utilizar uma polimerase e detectar a incorparação de cada uma das bases, o SOLiD utiliza octâmeros marcados com fluoróforos para identificar a sequência alvo. As primeiras 5 bases da probe garantem a especificidade da ligação da probe com o template, enquanto que as 3 útimas são inosinas que anelam de maneira inespecífica.

Conectado à última, inosina temos o fluróforo que gerará o sinal luminoso a ser detectado pelo sequenciador (ver fig 1.5).

Figura 1.5: Estrutura da probes utilizadas pelo SOLiD

No SOLiD, assim como no Ion Torrent, cada fragmento é amplificado milhares de vezes na superfície de uma bead5. Essas beads são então depositadas e fixadas em uma lâmina de vidro. É muito importante ter essa fixação, porque sabemos que o sinal luminoso que será gerado pelo processo de sequenciamento está vindo da mesma bead (ou seja, da mesma população de clones geradas de um template) por meio das coordenadas do ponto luminoso na lâmina. Notem que microsatélites com mais de uma base na repetição, como ACACAC, não são homopolímeros. Esses uma novo modelo do SOLiD, o 5500W, que não utiliza beads. A amplificação dos templates é feita diretamente na lâmina.

A reação de sequenciamento ocorre para cada um dos milhares de clones em cada uma das centenas de milhões de beads depositadas na lâmina. As etapas dessa reação são, de maneira simplificada, as seguintes:

1. Na etapa de construção de biblioteca, é adicionado um primer em cada extremidade de cada fragmento,

chamados de P1 e P2. No processo de sequenciamento é adicionado um primer complementar à P1, chamado de PA. A última base desse primer alinha com a última base de P1 (fig 1.6 A)

2. É adicionado um pool equimolar de probes. Como temos 4 bases diferentes e uma estrutura de 5 bases mais 3 inosinas, temos portanto 4ˆ5 = 1024 combinações diferentes de probes. As probes vão se anelar ao longo do template. Após o anelamento, é adicionada uma ligase, que vai fixar somente a probe que estiver ao lado de uma ponta 506. Após a fixação pela ligase ocorre uma lavagem e todas as probes não fixadas são removidas (fig 1.6 B)

3. É feita a leitura do floróforo. As inosinas, as três últimas bases da probe, são removidas junto com um floróforo, criando assim uma ponta 50 livre para fazer a ligação da próxima probe (fig 1.6 C)

4. É feita uma nova incorporação de probes e o processo se repete (fig 1.6 D)

Figura 1.6: Algumas etapas do processo de sequenciamento: ligação do primeiro primer.

A incorporação de probes é repetida 5, 7, 10 ou 15 vezes, dependendo do tamanho desejado de leitura.

Terminado esse ciclos o sistema é aquecido e a fita complementar ao template que foi gerada denatura e é eliminada. É então incorporado um novo primer, chamado de PB, que alinha uma base a esquerda de PA. Todo o processo de incorporação de probes é repetido, mas sempre com uma base à esquerda (fig1.7).

Na tabela 1.3 vemos a relação entre primer, ciclo e bases lidas. Vemos que a cada ligação de probe duas bases são lidas e que cada base é lida por duas probes diferentes. Por exemplo, a base s1 é lida pelo ciclo 1 do PA e pelo ciclo 2 do PB. Essa construção é chamada de Two Bases Encoding ou 2BE7, e permite que se faça depois a correção de erros que aumenta a acurácia do processo de sequenciamento e esta é a principal característica do SOLiD. Vale a pena também resaltar que na segunda ligação, a última base do primer P1 é sequenciada, isso é muito importante para fazer depois a decodificação das cores para bases. Duas probes consecutivas não ligam porque na extremidade 50

da probe tem o floróforo, que impede a ligação 50–30. Existe também uma codificação alternativa chamada de Four Bases Enconding, ou 4BE, que é opcionalmente utilizada

para fazer uma segunda correção de erros chamada de Exact Call Chemistry ou ECC.

O resultado do sequenciamento é codificado em números de acordo com a tabela 1.2. A relação entre as duas primeiras bases da probe, n1 e n2, e a cor do fluróforo é dada pela tabela 1.4. Essa tabela tem diversas propriedades interessantes: ela é simétrica e nenhuma cor se repete na mesma linha ou na mesma coluna (como em um jogo de Soduko). Por causa dessas propriedades temos que, se soubermos a primeira base do par e a cor fica determinada a segunda base. Suponhamos que a primeira base do par seja um T, se a cor lida pela probe for verde, a segunda base é, portano, um G.

Como o primeira probe do primer PB lê a última base do adaptar P1, que é conhecida, podemos portanto descobrir qual é a primeira base da leitura. Tendo a primeira base da leitura e a segunda cor, podemos descobrir a segunda base, e assim por diante. Podemos pensar nas cores como transformações entre bases, e que se essas transformações forem encadeads, podemos gerar todas as bases da leitura.

Figura 1.7: Algumas etapas do processo de sequenciamento: Ligação do segundo primer.

Tabela 1.4: Codificação de bases para cores 2.7. Aplicações do NGS

O número de aplicações do NGS é ilimitado. Qualquer coisa que possa ser transformada em DNA pode ser sequenciada utilizando o mesmo protocolo. Por isso, se alguém quiser criar uma nova análise, basta modificar a etapa de preparo de biblioteca e de análise e teremos uma nova aplicação. Mesmo assim, existe um grupo de aplicações que é mais utilizado pela comunidade científica.