Toxicidade da bilirrubina

São bem conhecidas as consequências de elevados níveis plasmáticos de BL circulante no recém-nascido (171, 231), nomeadamente na encefalopatia bilirrubínica (kernicterus) em que a bilirrubina é citotóxica. Apesar de se ter verificado que níveis normais da BNC conferem proteção contra danos oxidativos no cérebro (232), a sua elevada concentração pode causar alterações neurológicas e, inclusivamente, provocar a morte (171, 231). Para compreender os eventuais mecanismos da toxicidade da BL no cérebro e noutros tecidos foram realizados vários trabalhos experimentais em modelos animais e estudos in vitro. A célula neuronal e o eritrócito são modelos muito utilizados nestes estudos. Os primeiros trabalhos realizados indicaram como mecanismo básico, subjacente à toxicidade da BL, a inibição da fosforilação oxidativa (171). Verificou-se que a BL provocava a morte por apoptose nas células endoteliais microvasculares cerebrais de bovino, através da indução de marcadores apoptóticos, como a fragmentação de DNA e a clivagem da PARP (poly ADP ribose polymerase) (233). Rodrigues e colaboradores (234), demonstraram que a morte de neurónios cultivados na presença de BL, ocorria através de um mecanismo apoptótico, mediado pela mitocôndria, com perda de assimetria dos fosfolípidos. Mais recentemente, o mesmo grupo de trabalho verificou que a BL inibia seletivamente a atividade da citocromo c oxidase e induzia a apoptose em neurónios corticais imaturos (235). Tal como se observou para o seu efeito antioxidante, a toxicidade da BL ocorre a concentrações muito pequenas, na ordem dos micromoles (171). Os estudos sobre a toxicidade da BL foram também realizados em eritrócitos devido à sua acessibilidade, ausência de organelos intracelulares e as semelhanças de alguns componentes de membrana com outros tipos de células (236).

Dada esta dualidade da BL, pretendeu-se determinar a concentração a partir da qual a BL seria tóxica. A BL, em concentrações fisiológicas, protege os eritrócitos dos recém- nascidos contra o stress oxidativo, na presença de concentrações normais de Alb (237). Mas quando o valor de BL atinge os 30 mg/dL e a razão molar de BNC /albumina (BL/Alb) excede o valor de 1.0, há uma elevada toxicidade associada, dado que, nestas condições, aumenta a fração de BL livre, fração que pode facilmente inserir-se nas células e causar toxicidade (238). Uma revisão bibliográfica sobre a toxicidade da BNC no eritrócito mostrou que: a ligação da BNC aos eritrócitos humanos, durante a icterícia neonatal, provocava toxicidade; os eritrócitos neonatais eram mais propensos à toxicidade induzida por BNC do

que os eritrócitos de adultos; a BNC aumentava a formação de vesículas intracelulares em eritrócitos neonatais; a BNC lesava as propriedades dinâmicas da membrana, havendo um agravamento em condições de acidose (239).

Tal como se observa na toxicidade induzida pela elevada concentração de BL, que promove alterações na dinâmica da membrana do eritrócito, também há outras substâncias que podem induzir este tipo de perturbações. As modificações moleculares subjacentes à “desorganização” da membrana celular do eritrócito, na presença de substâncias tóxicas (240, 241), têm sido avaliadas através de estudos na proteína da banda 3, uma proteína transmembranar, que atua como trocador aniónico e constitui um elemento chave na manutenção da integridade da membrana (242). Apresenta um domínio externo, enriquecido em cadeias glicosil que, provavelmente, permite que a proteína seja reconhecida como um antigénio específico (242). Esta proteína, quer por clivagem proteolítica, agregação ou exposição de epítopos invulgares, induz a ligação de anticorpos naturais anti-banda 3 que desencadeiam ativação do sistema complemento (marcando a célula para morte), seguindo-se a opsonização e o reconhecimento final pelos macrófagos (243). A proteína banda 3 é, por isso, conhecida como neoantigénio de senescência.

Em eritrócitos humanos, a atividade de fosforilação da tirosina (P-tyr) de proteínas da membrana envolve principalmente a proteína banda 3 (244). Tem sido sugerido que a análise da atividade P-tyr possa servir como marcador do status da membrana em situações de toxicidade causadas pelo fármaco dapsona (240). Nestes trabalhos também foram analisadas as alterações moleculares na banda 3 (90, 240), os agregados de alto peso molecular e as formas monoméricas ou fragmentos proteolític0s, que são marcadores utilizados para estudar o dano oxidativo no eritrócito (245). A proteína banda 3 pode constituir, no futuro, um marcador poderoso de toxicidade e dano oxidativo.

A constatação de que a bilirrubina tem actividade antioxidante, assim como anti- inflamatória e anti-carcinogénica, veio enfatizar a importância de avaliar os fatores que possam modular os seus níveis plasmáticos, tanto na população em geral como em indivíduos com SG. Há vários fatores que se sabe terem influência nos níveis plasmáticos de bilirrubina, designadamente genéticos e não genéticos. Deste modo, o objetivo deste estudo foi analisar a contribuição de variáveis ambientais e das alterações no gene UGT1A1 (região reguladora e codificante) na modificação dos níveis plasmáticos de bilirrubina (artigo 1 e 2):

Artigo 1: Bilirubin is mainly dependent on UGT1A1 polymorphisms, hemoglobin, fasting time

and body mass index. Am J Med Sci 343(2):114-8; 2012.

Artigo 2: Impact of UGT1A1 gene variants on total bilirubin levels in Gilbert Syndrome patients

and in healthy subjects. Blood Cells Mol Dis. 2012; 48(3):166-72; 2012.

Durante muitos anos a bilirrubina foi considerada apenas um produto de excreção, sem qualquer significado biológico. No entanto, no final da década de 80 foi comprovada a capacidade antioxidante da bilirrubina e, no início da década de 90, foi demonstrado que os níveis plasmáticos de bilirrubina estavam inversamente relacionados com o risco de doença arterial coronária. Estes conhecimentos justificaram o desenvolvimento de vários trabalhos que apontam para o efeito protetor da bilirrubina nas doenças cardiovasculares e noutras patologias associadas com stress oxidativo. Assim, foi também objetivo deste trabalho confirmar o potencial antioxidante da bilirrubina, através da avaliação do impacto de níveis de bilirrubina ligeiramente aumentados, presente em indivíduos homozigóticos e heterozigóticos para a duplicação TA no promotor do gene UGT1A1, em diferentes marcadores sanguíneos de stress oxidativo, nomeadamente, utilizando o eritrócito como modelo de acumulação de danos oxidativos e quantificação de alguns parâmetros plasmáticos. Os resultados obtidos estão descritos no artigo 3:

Artigo 3: Bilirubin levels and redox status in a young healthy population. Acta Hematol 130:57-60; 2013.

Os estudos genéticos efetuados permitiram identificar 9 nsSNPs no gene UGT1A1, 2 já descritos na literatura e 7 detetados pela primeira vez neste estudo. Para avaliar a patogenicidade das variantes no gene UGT1A1 usaram-se várias ferramentas

bioinformáticas que têm a capacidade de predizer o fenótipo das novas variantes sem estudos funcionais. Os resultados obtidos são descritos no artigo 4:

Artigo 4: Performance of in silico tools for evaluating UGT1A1 missense variants (submetido para publicação).

Artigo I

Bilirubin Dependence on UGT1A1 Polymorphisms,