Uma vez que os parâmetros de crescimento haviam sido estabelecidos, restou o ensaio de toxicidade do solvente DMF usado na solubilização dos POPs e toxicicidade dos próprios POPs que são objeto de investigação nesse trabalho. Para a solubilização dos POPs, dois solventes são comumente encontrados na literatura, dimetilsulfóxido, DMSO, ou dimetilformamida, DMF (DEAN-ROSS e CERNIGLIA, 1996; JUHASZ et al. 2003; DAS e MUKHERJEE, 2007; KASEMODEL, 2012). Destes dois, definitivamente o DMF é o mais citado, por isso esse solvente foi escolhido para a realização dos experimentos. No entando, a toxicidade desse solvente não costuma ser indicada nos trabalhos de biodegradação de POPs, por isso realizou-se um ensaio de crescimento das bactérias
Sphingobacterium multivorum e Stenotrophomonas maltophilia sob diferentes
concentrações do solvente DMF. O resultado desse experimento encontra-se na Figura 2.24 abaixo:
FIGURA 2.24: Curva de crescimento para as bactérias A) Sphingobacterium
multivorum e B) Stenotrophomonas maltophilia sob diferentes concentrações do
solvente DMF (1, 2, 5 e 10% (V/V)).
Como pode ser observado na Figura 2.24, o solvente DMF apresentou grau de toxicidade diferenciado para as duas bactérias testadas. Esse solvente a 5% (v/v) foi muito mais tóxico par a S. multivorum do que para a S. maltophilia. Para a S.
maltophilia a concentração de 5% de DMF apresentou um efeito inibitório de 15%
em relação ao controle em 24 h de experimento. Por sua vez, para a S. multivorum, nas mesmas condições, o efeito inibitório foi de 76%. O DMF, no entanto, apresentou efeito inibitório superior a 90% para ambas as bactéria na concentração de 10% (v/v), indicando auto grau de toxicidade para essa concentração. Um
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resultado semelhante foi encontrado por Amin et al, (2010), num experimento para compostos com efeito antibacteriano, onde o solvente DMF também foi testado para a bactéria Staphylococcus capitis. Segundo esses autores, uma concentração de 1,3 mol.L-1, equivalente a 10% (v/v) de DMF matou 80% das bactérias, enquanto que as concentrações abaixo de 0,5 mol.L-1 (4% v/v) apresentaram efeito inibitório menor que 10%.
Por meio dos resultados apresentados para esse experimento optou-se pelo uso de concentrações não maiores que 2% (v/v) para o solvente DMF, evitando assim o estresse e morte das bactérias devido ao seu efeito tóxico. Geralmente os experimentos de biodegradação apresentados na literatura não indicam a concentração do solvente aplicada ao meio de cultura. Apenas um trabalho foi encontrado para o qual o autor diz usar a concentração de 5% (m/v) de DMF para o estudo da biodegradação de pireno por Bacillus subtilis e Pseudomonas aeruginosa (DAS e MUKHERJEE, 2007).
Outro fator que pode causar estresse e baixa viabilidade das bactérias estudadas é a aplicação de altas concentrações do próprio POP utilizado no experimento de biodegradação. Segundo Kasemodel (2012), bactérias marinhas selecionadas apresentaram baixa tolerância a pesticidas clorados, sendo este um critério para a rejeição destas bactérias no trabalho de biodegradação realizado pela autora. Deste modo, nesse trabalho procurou-se estabelecer a melhor concentração a ser utilizada no experimento de biodegradação a partir de concentrações encontradas na literatura. Nesse caso, a faixa de 10 a 100 µg.mL-1 foi selecionada para essa avaliação.
Para o estabelecimento da toxicidade dos compostos buscou-se, então, um método que fosse rápido e de menor custo devido à necessidade de um grande número de experimentos a ser realizado para isso. Sendo assim, por meio de uma busca a literatura, escolheu-se o método fluorimétrico com o uso do reagente resazurina para a determinação do crescimento microbiano (MARISCAL et al., 2009). Esse método foi escolhido, pois os experimentos são realizados em placas de Elisa com capacidade para 96 amostras, o que permite a obtenção de um grande número de dados de crescimento com replicatas em um curto espaço de tempo. A determinação da viabilidade celular com resazurina consiste basicamente na transformação desse composto por meio de uma reação de redução para resorufina (Figura 2.25) que é um composto com atividade fluorescente, quando
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excitado por uma fonte luminosa. Essa transformação da resazurina para resorufina está diretamente relacionada a enzimas bacterianas presentes em células vivas e pode, portanto, ser relacionado à viabilidade celular.
FIGURA 2.25: Figura representativa da reação da Resazurina a Resorufina em presença de células microbianas.
Para a realização desse ensaio foi obtido inicialmente uma curva de concentração da resazurina versus a fluorescência da resorufina com emissão em 590 nm, onde se elegeu a concentração de 0,2 µg.mL-1 como sendo a melhor concentração a ser utilizada nos ensaios. A concentração de 0,2 µg.mL-1, foi selecionada por estar num ponto razoavelmente central da curva de calibração e pertencer a uma faixa linear da mesma, conforme pode ser observado na Figura 2.26. A bactéria utilizada no experimento para a construção da curva foi a
Sphingobacterium multivorum que foi plaqueada em placa de ELISA escura na
concentração 105 obtida a partir de um pré-inóculo de 16 h. O volume total contido nos poços foi 200 µL (160 µL CN; 10 µL inóculo; 30 µL resazurina). O tempo de crescimento foi de 48 h e a resazurina foi adicionada apenas 40 min antes da leitura, ficando incubada junto às cepas na mesma temperatura de cultivo (28ºC) em estufa B.O.D.
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FIGURA 2.26: Fluorescência a 390 nm de uma cultura de bactérias de 48 horas de crescimento com leitura em fluorímetro sob diferentes concentrações do composto resazurina.
Uma vez estabelecida a curva de calibração, o método foi empregado na avaliação do crescimento microbiano para a presença dos POPs previamente selecionados por categoria. Para esses experimentos foi eleito um POP de cada classe química usado nesse trabalho, sendo eles 1,2,3,4-TCDD (classe das dioxinas), 4,4’-Diclorobifenila (PCB 15 - PCBs) e Antraceno (HPAs) e avaliado em quatro concentrações diferentes dos mesmos (100, 50, 20 e 10 µg.mL-1). O experimento foi realizado para as bactérias S. multivorum e S. maltophilia em quadruplicata, contando também com um controle positivo de morte, o qual consistia na submissão das cepas ao antibiótico tetraciclina na concentração de 0,5 mg.mL-1, e um controle negativo, no qual as cepas se encontravam em meio contento DMF a 2% (v/v). O resultado do experimento se pode ser visualizado nas Figuras 2.27 A-C e 2.28 A-C.
FIGURA 2.27: Ensaio de viabilidade celular para a bactéria Sphingobacterium
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FIGURA 2.28: Ensaio de viabilidade celular para a bactéria Stenotrophomonas
maltophila frente a A) dioxina; B) PCB e C) HPA, respectivamente.
Como podem ser observados nas Figuras 2.27 e 2.28, os experimentos apresentaram coeficiente de variação superior a 15% e irregularidades em relação às concentrações utilizadas, por isso não foi possível determinar a toxicidade dos POPs para as bactérias por meio deste ensaio. Isso se deve provavelmente a baixa solubilidade dos compostos que leva a um espalhamento de forma irregular do feixe luminoso, gerando uma leitura imprecisa e inexata das culturas. Apesar desse resultado, e do fato da resazurina não ser um composto tóxico para as bactérias, cada um dos poços usados no ensaio foi plaqueado em caldo nutriente ágar, para averiguar por meio desse teste a viabilidade celular em relação às diferentes concentrações. Com pode ser visto nas Figuras 2.29 e 2.30, mesmo permanecendo 48 h em contato com os diferentes POPs, nenhuma das bactérias estudadas deixou de apresentar crescimento nas placas. Deste modo, deduziu-se que nenhuma das concentrações aplicadas nesse ensaio foi efetivamente tóxica aos micro- organismos. Para os experimentos de degradação, portanto preferiu-se usar a concentração de 50 µg.mL-1, a qual foi com frequência usada nesse tipo de ensaio (NAM et al., 2006; Kasemodel 2012; GAO et al., 2013).
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FIGURA 2.29: Bactéria Sphingobacterium multivorum crescendo em ágar nutriente depois de ter sido submetida ao crescimento em meio caldo nutriente contendo diferentes concentrações de A) 1,2,3,4-TCDD, B) PCB 15 e C) antraceno.
FIGURA 2.30: Bactéria Stenotrophomonas maltophila crescendo em ágar nutriente depois de ter sido submetida ao crescimento em meio caldo nutriente contendo diferentes concentrações de A) 1,2,3,4-TCDD, B) PCB 15 e C) antraceno.