2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.5 Toxicidade dos compostos presentes nos hidrolisados aos micro-organismos
A Figura 2.5 apresenta um esquema das reações que acontecem durante a hidrólise ácida de materiais lignocelulósicos, na qual ocorre a liberação de açúcares e formação de compostos tóxicos à levedura, conforme já foi mencionado anteriormente (PALMQVIST; HAHN-HÄGERDAL, 2000a).
Figura 2.5. Esquema das reações que ocorrem durante a hidrólise ácida de
materiais lignocelulósicos (Baseado em PALMQVIST; HAHN-HÄGERDAL, 2000a; FONSECA, 2009).
Com relação ao ácido acético foi evidenciado em pesquisas com C. guilliermondii que o aumento da concentração deste no meio a valores
superiores a 3,0 g L-1 interferiu negativamente na bioconversão de xilose em xilitol por esta levedura durante fermentações realizadas em meio sintético, enquanto a presença deste ácido em baixas concentrações (1,0 g L-1) favoreceu esta bioconversão sendo a levedura capaz de assimilar todo o ácido durante o processo (FELIPE et al., 1995). Nas fermentações em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar, Lima et al. (2004), também verificaram a inibição dos parâmetros rendimento e produtividade de xilitol por C. guilliermondii só que em concentração acima de 5 g L-1 deste ácido. O favorecimento da fermentação
Furfural Ácido fórmico 5-Hidroximetilfurfural Ácido levulínico Arabinose
Biomassa Vegetal
Hemicelulose
Celulose
Lignina
Xilose
Manose Galactose Glicose Ácido acético
de xilose em xilitol por C. guilliermondii na presença de baixa concentração de ácido acético (1,0 g L-1), está relacionada ao fato de parte deste ácido poder entrar diretamente no ciclo de Krebs via acetil-CoA, enquanto concentrações maiores poderiam ser utilizadas por outras vias metabólicas dependentes de energia como o ciclo do glioxilato (FELIPE et al., 1995). Quanto à inibição da atividade exercida por altas concentrações de ácido acético, Palmqvist e Hahn- Hägerdal (2000a), atribuem aos mecanismos de sua incorporação e ao acúmulo intracelular de ânion. Estes autores propõem algumas teorias para o efeito deste ácido como a diminuição do pH intracelular resultante do refluxo de ácidos fracos em função da neutralização por ação da ATPase da membrana plasmática, a qual bombeia prótons para fora da célula com gasto de ATP. Em condições de forte acidez a capacidade de bombear o próton da célula é esgotada resultando em exaustão de ATP, dissipação da força próton motora e acidificação do citoplasma em função do acúmulo de ânions intracelular. De acordo com essa teoria a forma aniônica do ácido é capturada na célula e o ácido não dissociado se difunde dentro da célula até que o equilíbrio seja alcançado (PALMQVIST; HAHN- HÄGERDAL, 2000a).
Quanto aos compostos fenólicos, Villa et al. (1998) avaliaram o efeito tóxico do fenol durante a fermentação em meio semi-sintético por C. guilliermondii e verificaram que a presença de baixa concentração (0,1 g L-1) deste composto foi suficiente para reduzir drasticamente a produtividade de xilitol. Segundo estes autores, isto se deve provavelmente à inibição da atividade da xilose redutase ou transporte de xilose através da membrana plasmática, já que a assimilação de xilose foi também drasticamente afetada. Segundo Palmqvist e Hahn-Hägerdal (2000a) os compostos fenólicos causam perda da integridade da membrana biológica, afetando sua habilidade de barreira seletiva e matrizes enzimáticas, observando-se a diminuição da inibição da fermentação quando monômeros de ácidos fenólicos são significativamente removidos do hidrolisado.
Em relação ao furfural e 5-hidroximetilfurfural foi constatado inibição do crescimento de C. guilliermondii pela presença de diferentes concentrações destes compostos durante o cultivo desta levedura em batelada e em condições aeróbias (SANCHEZ; BAUTISTA, 1988). Segundo estes autores quando da utilização de concentrações de 1,0; 1,5 e 2,0 g L-1 de furfural e 5- hidroximetilfurfural acarretaram em inibição do crescimento de 30,3; 70,0 e 100%
e de 7,7; 30,3 e 61,7%, respectivamente, sugerindo ser o furfural um inibidor do crescimento mais forte do que o 5-hidroximetilfurfural. Estes autores também observaram que a capacidade desta levedura em metabolizar estes componentes é diferente, em função da velocidade de assimilação, uma vez que o furfural é consumido mais rapidamente em relação ao 5-hidroximetilfurfural. Segundo os autores, isto sugere que as enzimas para o metabolismo de furfural possam ser constitutivas na levedura. Ainda de acordo com estes autores, o furfural e 5- hidroximetilfurfural atuam em enzimas como triose-fosfato desidrogenase e álcool- desidrogenase. Da mesma forma, Delgenes, Moletta e Navarro (1996) relataram que os crescimentos de Pichia stipitis e Saccharomyces cerevisiae em meios sintéticos foram reduzidos em 100% quando a concentração de 5- hidroximetilfurfural adicionada no meio foi de 1,5 e 1,0 g L-1, indicando que o efeito inibitório variou com o tipo de cepa.
Poucos estudos existem na literatura sobre o efeito dos cátions metálicos no metabolismo de leveduras, o que está bem elucidado são os mecanismos de transporte destes usando os recursos da biologia molecular (GABER, 1992). Os cátions metálicos são assimilados por várias razões, mas principalmente para regulação do pH e geração de força próton motora (no caso de transporte de íons H+); osmorregulação e balanço de carga (no caso de K+); funções de cofatores enzimáticos (no caso de Mg2+ e Mn2+) e de metaloenzimas estruturais (no caso de Fe2+, Zn2+ e Ni2+) e ainda sinal de mensageiro de transdução (no caso de Ca2+) (WALKER, 1998).
De acordo com Watson et al. (1984) em fermentações pela levedura Pachysolen tannophilus contendo 10 g L-1 de xilose no meio, a presença de apenas 0,01 g L-1 dos íons níquel e cromo inibiu fortemente o crescimento desta levedura e a produção de etanol, o que não foi observado para o íon cobre nesta mesma concentração devido ao seu efeito tóxico ter sido menos evidenciado em relação aos demais íons. Da mesma forma, em pesquisas realizadas por Dönmez e Aksu (2001) também foi constatado uma maior sensibilidade ao íon níquel em comparação ao cobre para Candida sp. cultivada em meio composto por 30 g L-1 de glicose. Segundo Kleinzellear e Kotyka, (1967)3 apud Watson et al. (1984) os
3 KLEINZELLER, A.; KOTYK, A. Transport of monosaccharides in yeast cells and its relationship to cell
metabolism. In: Aspects of Yeast Metabolism, pp. 33-45, 1967. Edited by A. K. Mills & H. Krebs. Philadelphia:
íons níquel podem inibir parcialmente o consumo de açúcares em leveduras por ligarem-se a superfície da célula.
Com relação ao íon ferro, Watson et al. (1984) verificaram que concentrações de 0,5 g L-1 deste em meio contendo 10 g L-1 de xilose resultou em decréscimo de aproximadamente 45% da produção de etanol por P. tannophilus.
Pesquisas com D. hansenii revelaram forte inibição da enzima xilitol desidrogenase quando a concentração do íon zinco no meio foi de 0,75mM adicionado na forma de cloridrato de zinco (GÍRIO; PELICA; COLAÇO, 1996).
A identificação dos íons metálicos que interferem no metabolismo de leveduras é importante uma vez que estes interferem na regulação da assimilação de açúcares e outros compostos solúveis, bem como no crescimento celular (WALKER, 1998).
2.6 Procedimentos de destoxificação do hidrolisado hemicelulósico de