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Dinâmica dos fatores angiogênicos em corpos lúteos de cadelas gestantes e pseudogestantes
A. A. Ribeiroa, A. A. P. Derussib, P. P. Freirea, M. Dal Paia, P. C. Papac, M. D. Lopesa, M. C. Meinsohnd, B. D. Murphyd.
a Universidade Estadual Paulista (UNESP), Botucatu, São Paulo, Brazil b Universidade José do Rosário Vellano, Alfenas, Minas Gerais, Brazil c Universidade de São Paulo (USP), São Paulo, Brazil
1. INTRODUÇÃO 1
A fisiologia reprodutiva canina apresenta diversas particularidades e a 2
semelhança entre a duração da fase lútea em cadelas gestantes e não- 3
gestantes continua sendo uma das características mais intrigante e ainda alvo 4
de muitos estudos [1, 2, 3]. A fase lútea nas cadelas é identificada por uma 5
ação plena do corpo lúteo: glândula endócrina transitória,caracterizada por um 6
rápido crescimento das células da teca e da granulosa de folículos ovulatórios 7
[4, 5]. Durante a fase lútea das cadelas não existem variações consideráveis 8
nos processos de formação e manutenção do corpo lúteo (CL) e nem mesmo 9
diferenças significativas no perfil esteroidogênico entre fêmeas em diestro 10
cíclico e gestacional [6]. 11
A única fonte de progesterona durante a gestação nas fêmeas caninas é 12
o corpo lúteo. Após 15 a 30 dias da onda pré-ovulatoria de LH a secreção de 13
progesterona pelo CL atinge uma concentração máxima em torno de 15 a 80 14
ng/mL, com uma variação individual grande [6, 7]. A partir desse ponto uma 15
regressão gradual torna-se obvia e os níveis de P4 diminuem lentamente [8, 9]. 16
A regulação da função lútea é realizada por um grupo de agentes que 17
interagem na busca da homeostasia da glândula, portanto, as células que 18
originam o corpo lúteo sofrem influência de vários fatores angiogênicos e 19
mitogênicos [10]. Os reguladores primários da angiogênese ovariana 20
pertencem às famílias dos fatores de crescimento do endotélio vascular 21
(VEGFs) [11]; outros fatores envolvidos na angiogênese são os fatores de 22
crescimento semelhante à insulina (IGFs) e suas proteínas de ligação 23
(IGFBPs), fatores vasoativos (endotelina, angiotensina, óxido nítrico) e fatores 24
antiangiogênicos (THBS e TGFB1). Esses agentes angiogênicos atuam no 25
processo de formação do CL, mas também agem diretamente na regressão do 26
CL [12]. Durante a luteólise, o CL perde a capacidade de sintetizar P4, devido à 27
uma diminuição do aporte sanguíneo às células lúteas e um aumento na ação 28
do sistema imunológico com envolvimento de agentes vasoconstritores e 29
quimiotáticos, seguido pela perda das células que o compôem [13]. 30
A maioria dos fatores angiogênicos já caracterizados estão relacionados 31
com a fase de formação do CL, portanto a maior parte das informações 32
existentes refere-se principalmente aos mecanismos luteotróficos. Os 33
mecanismos associados à luteólise e as vias moleculares de sua regulação em 1
cadelas prenhes e não prenhes ainda não são bem elucidados. De maneira 2
geral, muitos fatores estão envolvidos nos processos de regressão funcional e 3
estrutural do CL na espécie canina, assim como no desencadeamento do seu 4
processo de lise. Portanto o objetivo desse trabalho foi avaliar a expressão de 5
fatores angiogênicos - VEGFA, IGFBP5, Endotelina, THBS2 e TGFB1 6
previamente selecionados pela técnica de RNAseq – em diversos momentos 7
da fase lútea (10, 20, 40 e 60 dias) de fêmeas gestantes e não-gestantes 8
através das técnicas de qRT-PCR e imunofluorescência. 9
10
2. MATERIAIS E MÉTODOS 11
Essa proposta foi aprovada pelo comitê de ética da Universidade 12
Estadual Paulista – UNESP-Botucatu, sob registro 168/2013 CEUA. 13
14
2.1.Animais
15
Foram utilizadas 40 cadelas, sem raça definida, com idade entre 1 a 6 16
anos, pesos equivalentes, boa condição de saúde, com histórico de fertilidade 17
comprovada, atendidas no Ambulatório de Reprodução de Pequenos Animais 18
do Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária, da 19
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da UNESP, Botucatu, cujos 20
proprietários tinham interesse em realizar a ovariohisterectomia (OSH) eletiva 21
em seus animais. 22
23
2.2.Estimativa do momento de ovulação
24
A ovulação foi estimada baseando-se na concentração sérica de P4 e 25
citologia vaginal. No momento em que a concentração de P4 atingiu 4 ng/ml, e 26
a porcentagem de células superficiais igual ou superior a 90% na citologia 27
vaginal, foi considerado como o dia da ovulação, ou seja, dia 2 (48 horas após 28 onda pré-ovulatória de LH) [14]. 29 30 2.3. Citologia vaginal 31
Os exames citológicos foram realizados com o uso de escova 1
ginecológica. As lâminas foram coradas pelo Panótico (Hematocor®) e a 2
identificação dos tipos celulares foi baseada nos critérios adotados por 3
Johnston et al. [9], ou seja, na porcentagem de células superficiais sob 4
microscopia de luz (aumento de 200x) para animais em fase folicular e na 5
ausência desse tipo celular, para animais em diestro e anestro. 6
7
2.4. Dosagem de progesterona sérica
8
As dosagens de P4 foram realizadas no momento do exame clínico 9
inicial, prosseguindo em dias alternados a partir do momento em que as células 10
superficiais atingiram 80% no exame de citologia vaginal até a realização da 11
segunda inseminação e também no dia da OSH. 12
13
2.5. Protocolo de inseminação artificial (I.A.)
14
Foram realizadas duas I.A. no fundo da vagina, com intervalo de 48 15
horas, nos dias D4 e D6 da onda pré-ovulatória de LH. O sêmen foi obtido 16
sempre de um mesmo macho adulto, saudável, com testes negativo para 17 brucelose e leptospirose. 18 19 2.6. Ovariosalpingohisterectomia (OSH) 20
As medidas pré-operatórias adotadas incluíam: jejum sólido de 12 horas 21
e hídrico de 3 horas. O procedimento anestésico consistiu em: 0,05 mg/Kg de 22
acepromazina e 0,5 mg/Kg de morfina, por via intramuscular como medicação 23
pré-anestésica e após 10 minutos foi realizada a indução anestésica com 5 24
mg/kg de ketamina e 0,25 mg/Kg de diazepam, por via intravenosa e 25
manutenção da anestesia inalatória com isoflurano. Como terapia pós- 26
operatória, foi recomendado 0,1 mg/Kg de meloxican durante 2 dias e 27
antibioticoterapia. 28
29
2.7. Divisão dos grupos experimentais:
30
As cadelas foram divididas em 02 grupos: 31
GRUPO I (diestro ciclico) - 20 cadelas, não inseminadas, que foram