Transcriptoma por RNA-seq

Inicialmente foi proposto no presente trabalho caracterizar e comparar quatro perfis (1, 7, 14 e 21 dias infectados com X. fastidiosa) de expressão gênica global de laranja Pera e tangerina Poncan através da construção de SSHs. No entanto, devido ao insucesso dessa metodologia foi necessária a alteração da técnica para as análises de

expressão gênica. Nós optamos pela técnica de RNA-seq que permite analisar transcriptomas complexos, independente de conhecimento prévio do genoma. Além disso, possui uma faixa de detecção muito maior quando comparada a técnica de microarranjo de DNA (9.000 vezes versus ~100 vezes) (Marioni et al., 2008; Wang et

al., 2009). Devido à grande quantidade de informações obtidas a partir da técnica de

seqüenciamento de nova geração e os custos envolvidos, foi decidido avaliar a expressão global por RNA-seq de somente um tratamento após a infecção, sendo que demais tratamentos foram avaliados pela expressão específica de genes selecionados através de PCR quantitativo em tempo real (RT-qPCR).

5.3.1.Experimento Piloto

Para a seleção de qual seria o tratamento mais relevante para observar a resposta inicial à infecção por RNA-seq, foi realizado um experimento piloto com quatro tratamentos (tempos após infecção) em plantas de tangerina Poncan utilizando-se genes previamente avaliados no transcriptoma de citros (CitEST). Foram selecionados alguns genes que apresentaram indução em plantas de tangerina Poncan após 30 dias do desafio com X. fastidiosa. Dentre eles estão o CC-NBS-LRR, que percebe sinal molecular da bactéria e desencadeia a cascata de sinalização; pad4 envolvido na síntese do ácido salicílico (AS), pr1 que é uma proteína-PR, o npr1, que é requerido na transdução de sinal de AS, e por fim, o gene apetala envolvido na via de sinalização do etileno, uma das respostas mais tardia da planta à infecção (De Souza et al., 2007b) (Tabela 1).

Tabela 1: ORFs do CitEST com potencial para avaliação da expressão diferencial.

ORF Função Putativa

CC-NBS-LRR type disease resistance protein Resistência a fitopatógenos apetala2/ethylene responsive factor Sinalização celular

pad4 Envolvido na via do AS

npr1 Indutor de proteínas PR

O RNA total foi extraído com Trizol (Invitrogen Life Technologies) e tratado com DNase RNase Set-Free (Qiagen), formando um conjunto de três repetições biológicas de tangerina Poncan para cada tratamento, infectado ou não.

Para síntese de cDNA foram utilizados 500 ng/μl de RNA total e a reação

efetuada conforme instruções do fabricante (Fermentas). Esses cDNAs foram utilizados

em triplicatas na seguinte reação: 2μl de cDNA diluído (1:25); 1,5µM de cada primer

(direto e reverso) e 12,5 µL do “SYBR green PCR master mix” (Applied Biosystems), o

volume final foi ajustado para 25 µL com água Milli-Q. As reações foram incubadas a

50ºC por 2 min, 10 mim a 95ºC e 40 ciclos de 15s a 95ºC e 1min a 60ºC. As amplificações foram conduzidas no ABI PRISM 7500 Fast SDS versão 1.4 (Applied Biosystem).

A detecção dos produtos de PCR foi medida por monitoramento do aumento da fluorescência emitida pelo marcador SYBR green que está intercalado na fita dupla de

DNA. O gene que codifica para ȕ-tubulina foi utilizado como controle endógeno (CE)

para normalizar as amostras das possíveis diferenças de concentrações de cDNAs. Os resultados foram normalizados usando o valor do Ct obtido do CE. Este é um valor numérico designado para cada corrida, onde o nível de fluorescência da reação é detectada durante a fase exponencial. Para a normalização foi utilizada a equação ǻCt = Ct (gene alvo) - Ct (controle endógeno). O aumento dos níveis de expressão do gene alvo para cada condição foi calculado através da equação: ǻǻCt = ǻCt (amostra) - ǻCt (calibrador). O calibrador é o valor obtido para uma amostra específica. O aumento nos níveis de expressão é sempre obtido em relação ao calibrador específico utilizado. Neste caso, foi utilizado o valor obtido da planta não inoculada com o patógeno. A quantificação foi obtida por 2-ǻǻCt (Livak & Schmittgen, 2001). As médias das três repetições biológicas de cada amostra com os diferentes genes analisados foram comparadas aplicando o teste t (P ” 0.05).

Para todas as amplificações feitas no RT-qPCR foi realizada uma curva de dissociação para a verificação de amplificações inespecíficas decorrentes de possíveis contaminações.

A partir do perfil de expressão escolhido foi iniciado o preparo das amostras que foram enviadas para empresa Macrogen (Coréia do Sul), para sequenciamento utilizando a plataforma Genome Analyzer IIx (Illumina). O material vegetal utilizado foi o mesmo usado em todos os experimentos desse trabalho.

O RNA total foi extraído e tratado como descrito no experimento piloto. Foram extraídas amostras de RNA de três repetições biológicas independentes para cada genótipo (laranja Pera e tangerina Poncan) infectado após um dia e seus respectivos controles (não infectados) de folhas e também do tecido xilemático das plantas de Poncan. Os RNAs foram avaliados quanto a sua qualidade e integridade em “RNA Nano Labchips” no aparelho Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies). As amostras de RNA também foram quantificadas no spectrophotometer nanodop 8000 (Uniscience) e armazenados a uma temperatura de -80ºC.

Após essas verificações foram enviados à empresa 10 μg dos RNAs totais.

Assim que as amostras foram recebidas pela empresa, passaram pelo equipamento Bioanalyser 2100 (Agilent) para a verificação da qualidade novamente.

O sequenciamento da laranja Pera e tangerina Poncan (tecido foliar) ainda está em andamento. Portanto, não houve tempo hábil para incluir esses resultados nessa etapa. Portanto, a análise se concentrou nos resultados de tecidos xilemático, sadio e infectado, de tangerina Poncan.

Os resultados de RNA-seq foram enviados no formato fasta, bem como os

arquivos de qualidade similar ao Phred •20 (Ewing et al., 1998). Essas sequencias

foram mapeadas contra o genoma referência de Citros clementina utilizando o programa TopHat, o qual pode alinhar fragmentos de splicing (Trapnell et al., 2009). Após o alinhamento, as sequencias codantes foram usadas para medir a abundância relativa através do programa Cufflink, o qual mede a abundância da transcrição em fragmentos por kilobase de exon por milhão de fragmentos mapeados (FPKM) (Trapnell et al., 2010). A quantificação dos transcritos foi usada para calcular o nível de expressão diferencial entre tangerina Poncan inoculada com a bactéria e não inoculada (controle) e suas significâncias no Cuffdiff (Trapnell et al., 2010). Os transcritos diferencialmente expressos foram anotados e categorizados automaticamente no GO (Gene Ontology).