2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
5.9 Clonagem e expressão heteróloga da xilanase VI em E.coli Rosetta-gami
5.9.2 Transformação e detecção da atividade xilanolítica
A linhagem de E. coli TOP10 foi transformada com o vetor de expressão pET24b contendo o inserto da xilanase VI. Os transformantes foram selecionados pela capacidade de crescimento em meio mínimo suplementado com antibiótico Canamicina.
A transformação em E. coli TOP10 resultou em aproximadamente 40 clones dentre os quais foram escolhidas 6 para realização do PCR de colônia (figura 40).
Figura 40 - Gel de agarose 1% contendo as reações dos PCRs de colônia dos transformantes em bactéria E. coli Top10 (1 ao 6) e em Rosetta-gami (DE3) (7 ao 12), contendo o plasmídeo completo pET24b + xilanase VI.
E.coli TOP10 E.coli Rosetta-Gami
Fonte: Arquivo pessoal
Após a confirmação da presença de banda em torno de 1323 pb, foi feito um screening destes clones, cultivando-os em meio mínimo com antibiótico para posterior extração do seu DNA plasmidial e transformação em E. coli da linhagem Rosetta-gami, realizada conforme metodologia. Desta etapa foi possível obter aproximadamente 80 10.000 pb 6.000 pb 3.000 pb 1.500 pb 250 pb P 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
109
Fonte: Arquivo pessoal
clones dos quais foram selecionadas novamente 6 para o PCR de colônia. Foi feito um novo gel de agarose 1% contendo as 6 primeiras reações do PCR de colônia em E. coli TOP10 seguido das 6 últimas reações do PCR de colônia da transformação em E. coli Rosetta-gami. Como demonstrado na figura 40, para todas as colônias testadas, o resultado foi positivo para o aparecimento de banda em torno de 1323pb.
Após a seleção do clone com maior produção, foi feita indução da xilanase VI em meio com IPTG por 24h. Foi analisado tanto o sobrenadante obtido após a clivagem da parede celular bacteriana, quanto o pellet contendo as células clivadas. O ensaio de atividade em xilana de beechwood, indica a presença da xilanase VI somente no sobrenadante, que apresentou uma atividade de 19,7 U/mL. Foi feito também um ensaio de Bradford para medir a quantidade de proteína total que resultou em um valor de 151,5 µg/mL. Com esta quantidade de proteína, realizou então o gel SDS-PAGE e verificou-se que a banda próxima à 50kDa estava realmente presente no sobrenadante do cultivo, o que implica que a proteína foi expressa em meio intracelular e liberada após sonicação das células (figura 41).
Figura 41 - Gel de poliacrilamida SDS-PAGE (12%) corado com coomassie blue R-250 do cultivo de E. coli Rosetta-gami (DE3) transformada com o plasmídeo pET24b+xilanase VI. A
banda mais intensa presente na fração 1 com massa molar de aproximadamente 57 kDa foi atribuída a xilanase VI. P – padrão, 1 – sobrenadante do lisado celular, 2 - pelett contendo as células sonicadas. 97 kDa 66 kDa 45 kDa 30 kDa 21 kDa 14 kDa P 1 2
110
O extrato obtido após a sonicação das células de E. coli foi analisado em xilana beechwood, nos tempos de 5, 10 e 15 minutos. Em paralelo avaliou-se o extrato obtido da clonagem da xilanase VI em A. nidulans. Como pode-se observar no gráfico da figura 42, o sistema de expressão em bactéria aparentemente se apresenta como sendo mais eficiente para a produção desta xilanase, já que, para as mesmas condições de reação, o extrato obtido pela bactéria apresentou mais que o dobro de liberação de açúcares redutores a partir de xilana. Sendo assim, trabalhos futuros com a xilanase VI, deveria considerar este resultado e utilizar este sistema de clonagem e expressão a fim de se obter quantidades superiores de enzima para viabilizar sua purificação e utilização em maior escala.
Figura 42 - Perfil de atividade da xilanase VI obtido pelo sistema de expressão em fungo
A.nidulans (laranja) e em bactéria E.coli Rosetta-gami (DE3) (azul), incubadas à 50oC e pH
4,8.
Fonte: Arquivo pessoal
5.10 Clonagem e expressão da xilanase VI em Pichia pastoris
A fim de analisar a expressão do gene da xilanase VI de T. reesei em P. pastoris foram testados dois vetores, um constitutivo (pGAPαZ A) e outro induzível pela presença de maltose (pPICαZ A). Ambos foram extraídos de bactéria E. coli da cepa TOP10, que já continha esses vetores abertos e, posteriormente, purificados. Os rendimentos em termos
111 10.000 pb 6.000 pb 3.000 pb 1.500 pb 250 pb
Fonte: Arquivo pessoal de concentração, bem como a razão 260/280 (que avalia a contaminação do DNA por proteínas) estão demonstrados na tabela abaixo.
Tabela 15 - Quantificação dos vetores extraídos do cultivo líquido da bactéria E. coli TOP10 e purificados com o Kit Miniprep da Promega.
Vetor Cultivo Concentração (ng/µL) Razão 260/280
pPICαZ A 1 140,5 1,70
pPICαZ A 2 149,4 1,73
pGAPαZ A 1 141,5 1,90
pGAPαZ A 2 95,8 1,70
Fonte: arquivo pessoal
Com base nestes resultados, optou-se por prosseguir com o vetor pPICαZ A.2 e o pGAPαZ A.1 por conter as maiores concentrações de DNA e uma melhor razão 260/280. A reação de amplificação do fragmento do cDNA da xilanase VI utilizando os primers contendo os sítios das enzimas EcoRI e XbaI foi confirmada como positiva para a presença da banda em torno de 1500 pb através da aplicação em um gel de agarose 1% (figura 43).
Figura 43 - Gel de confirmação da amplificação do cDNA do fragmento da xilanase VI com os primers para clonagem em P.pastoris.
112
Os vetores isolados e purificados foram então digeridos com as enzimas de restrição EcoRI e XbaI em etapas separadas, bem como o fragmento da xilanase VI obtido anteriormente. Os produtos das três reações de digestão foram aplicados em um gel de 1% de agarose para verificação das bandas correspondentes aos vetores (em torno de 3000pb) e ao inserto (1500pb), mostrado na figura 44.
Figura 44 - Gel de confirmação da digestão com as enzimas de restrição EcoRI e XbaI, do 1. inserto da xilanase VI, 2. vetor pPICαZ A, 3. vetor pGAPαZ A.
Fonte: Arquivo pessoal
Tanto o pGAP quanto o fragmento da xilanase VI foram purificados com o Kit da Promega descrito na metodologia, porém o vetor pPIC teve que ser purificado previamente clivando-se a banda correspondente a ele (3000pb) do gel de agarose e em seguida purificado com o Kit para purificação em gel da Promega®, já que ele não apresentou uma clivagem com 100% de eficiência, visto que apareceram bandas maiores que representam as porções do plasmídeo que não foram clivadas com as enzimas de restrição. Para isso, foi preciso correr outro gel de agarose 1% para verificação da correta clivagem do vetor pPICαZ A do gel anterior (figura 45).
P 1 2 3 10.000 pb 6.000 pb 3.000 pb 1.500 pb 250 pb
113
Figura 45 - Gel de confirmação do pPICαZ A digerido pelas duas enzimas de restrição EcoRI e XbaI e purificado do gel.
Fonte: Arquivo pessoal
Feito isso, foi possível prosseguir com a reação de ligação entre os vetores e o fragmento da xilanase VI e em seguida com a primeira etapa de transformação em E. coli TOP10 para duplicação do plasmídeo construído. Foram escolhidas aleatoriamente 3 colônias transformantes de cada vetor para realização do PCR de colônia e análise em gel de agarose 1%. Nota-se, pela figura 46, que a transformação com o vetor pPICαZ A não obteve sucesso, visto que não possível a visualização da banda correspondente ao tamanho do gene da xilanase VI. Por este motivo, a próxima transformação em Pichia pastoris foi realizada somente com a construção que obteve resultado positivo para o PCR de colônia, com o vetor pGAPαZ A.
Após a visualização das bandas, o DNA plasmidial das colônias C.4, C.5 e C.6 foram extraídos, purificados e quantificados em espectrofotômetro Nanodrop® para decidir com qual colônia seria feita a transformação em P. pastoris (tabela 16). Como a colônia C.5 apresentou a maior quantidade de DNA e uma boa razão 260/280, foi feita a linearização do plasmídeo para uma melhor inserção no material genômico da levedura.
10.000 pb 6.000 pb
3.000 pb
1.500 pb
114
Figura 46 - Gel de confirmação dos PCRs de colônia da bactéria E. coli Top10 transformada com o plasmídeo pPICαZ A com o inserto xilanase VI (C.1, C.2, C.3) e com o plasmídeo pGAPαZ A com o inserto xilanase VI (C.4, C.5, C.6).
Fonte: Arquivo pessoal
Tabela 16 - Quantificação dos plasmídeos pGAP+GH30 extraídos das colônias transformantes positivas de E. coli TOP10.
Plasmídeo Concentração (ng/µL) Razão 260/280
pGAP + GH30 C.4 248,6 1,65
pGAP + GH30 C.5 303,05 1,70
pGAP +GH30 C.6 120,90 1,71
Fonte: Arquivo Pessoal
Os plasmídeos após reação de linearização do DNA foram passados pelo gel de agarose para verificação da correta linearização e posterior transformação (figura 47).
10.000 pb 6.000 pb 3.000 pb 1.500 pb 250 pb P C.1 C.2 C.3 C.4 C.5 C.6
115
Figura 47 - Gel de confirmação da linearização do plasmídeo pGAPalfaA inserto do gene da xilanase VI das três colônias transformantes positivas de E. coli Top10.
Fonte: Arquivo pessoal Após esta etapa foi feita a purificação dos vetores linearizados e transformado nas células competentes de P. pastoris. Porém não foi possível observar o surgimento de nenhuma colônia transformante, após 4 dias de incubação a 30oC. O que indica um
possível erro na no procedimento de competência das células ou da transformação. Portanto, não foi possível prosseguir com o experimento de clonagem e expressão em P. pastoris. Trabalhos futuros poderiam testar esta metodologia refazendo o procedimento de competência das células da levedura e otimizando as condições da transformação.
10.000 pb 6.000 pb 3.000 pb 1.500 pb 250 pb P C.4 C. 5 C.6
116
6 CONCLUSÕES
O gene da xilanase VI de Trichoderma reesei QM6a (entrada no Uniprot GORV92) foi clonado e expressado em Aspergillus nidulans e Escherichia coli cepa Rosetta-gami (DE3), com o intuito de obter a enzima para ser utilizada na extração de xilanas de bagaço de cana-de-açúcar.
Dos resultados obtidos, pôde-se concluir que:
- Quanto ao sistema para expressão da xilanase, verificou-se um resultado positivo quando realizado em Escherichi coli e em A. nidulans;
- O cDNA correspondente a essa enzima foi clonado, mas tentativas iniciais de expressar a enzima em P. pastoris não foram bem-sucedidas;
- Esse foi o primeiro relato da clonagem e expressão do gene da xilanase VI de T. reesei QM6a em A. nidulans A773, sendo um passo importante para originar outros estudos sobre esta enzima. As características observadas na enzima recombinante de A. nidulans foram:
✓ A ação da xilanase VI sobre diferentes xilanas comerciais confirmou que ela é dependente de resíduos de ácido glucurônico para a sua clivagem. Essa característica se manteve antes e depois da purificação parcial desta proteína. ✓ Os parâmetros físico-químicos encontrados para a xilanase VI (pH ótimo - 4.8,
temperatura ótima -50oC, massa molar de 57 kDa) foram os mesmos reportados pela transformação em A. oryzae, podendo concluir ser esse sistema de expressão adequado a clonagem e expressão do gene da xilanase VI.
✓ Foi possível realizar a caracterização cinética da xilanase VI elaborando um modelo para verificar a inibição pelo produto.
✓ A ação do EDTA na atividade de xilanase em pH 4,8 foi bastante marcante nas duas concentrações utilizadas, reduzindo-a em até 45%.
✓ Com a utilização desta enzima pôde-se obter xilanas de alta massa molar e não somente oligossacarídeos, ao contrário do que ocorre quando se utilizada xilanas convencionais como aquelas da família GH10 e GH11, mesmo partindo de diferentes fontes de xilanas como beechwood e xilana extraída do bagaço de cana de açúcar.
117
✓ As xilanases da família GH30 foram capazes de atuar no bagaço de cana pré- tratado quimiomecanicamente de forma que as xilanas solubilizadas apresentaram maior grau de polimerização quando se comparado à xilanases da família GH11. ✓ As características observadas na xilanase VI sugerem um grande potencial
biotecnológico para esta enzima. A partir dos resultados desta dissertação, novos estudos permitirão a adequação desta enzima para a aplicação em processos industriais associados a industria de alimentos, farmacêutica e de celulose e papel.
118
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