Transmissão entre animais e humanos

A literatura referencia que já se procedeu à identificação do Cryptosporidium em vários mamíferos, nomeadamente, animais de estimação, gado bovino, aves e répteis [12].

As espécies C. parvum e C. andersoni demostraram ser importantes a nível zoonótico. Os vitelos recém-nascidos afetados estão, na sua maioria, infetados com C. parvum enquanto os vitelos mais jovens com C. andersoni [12].

A transmissão dá-se através do contacto direto com o vitelo infetado ou através do consumo de água, estando este, segundo a literatura implicado na origem de pelo menos um surto aquático [12].

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Ainda, segundo a literatura, é possível referir que o C. parvum é menos frequente nas ovelhas e cabras, apesar de serem referidos casos de transmissão entre o C. parvum dos cordeiros e os tratadores dos animais [12].

Em relação aos animais domésticos, nomeadamente o cão e o gato, segundo a literatura, normalmente estão infetados com o hospedeiro adequado à sua espécie, C. canis e C. felis respetivamente, não constituindo importantes reservatórios de Cryptosporidium [12].

No entanto, estas espécies, incluindo também o C. suis, podem, eventualmente, provocar infeções esporádicas nos humanos, sobretudo através de contacto direto [12].

O risco de transmissão cruzada aos humanos está relacionada com o genótipo do parasita, sendo necessário recorrer à caracterização molecular para avaliar a sua relevância a nível epidemiológico.

2.7 Patologia

2.7.1 Manifestações Clínicas

A Criptosporidiose afeta principalmente a superfície do epitélio intestinal e em menor extensão o epitélio do trato gastrointestinal e respiratório. As manifestações clínicas estão relacionadas com a infeciosidade do parasita, assim como da resposta imunológica do indivíduo afectado [12].

As características da Criptosporidose variam conforme se trate de indivíduos imunocompetentes, indivíduos imunocomprometidos, crianças com idade inferior a 2 anos ou idosos.

Nos países industrializados e não industrializados, a maioria dos casos em indivíduos imunocompetentes é assintomática ou auto-limitante atingindo principalmente crianças e adultos. Nestes, as manifestações clinicas oscilam entre assintomáticas, diarreia aguda (mais comum) e diarreia severa [36].

Nos países industrializados, a diarreia aguda e crónica devido a C. parvum, está associada com a malnutrição e com as altas taxas de morbilidade e mortalidade [37]. Na maioria dos pacientes imunocompetentes, a infeção resulta em gastroenterite caracterizada por fadiga, anorexia, dores abdominais, cãibras, náuseas, perda de peso [36]. A diarreia apresenta algumas características: é aquosa com muco;

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volumosa; sem leucócitos ou sangue; apresenta um cheiro fétido e, ocasionalmente, pode ser explosiva [36]. Nos indivíduos imunocompetentes, os episódios de diarreia têm, normalmente, uma duração de 1 semana podendo, em alguns casos, estender- se até 1 mês e, mais raramente, até 4 meses [36].

Os indivíduos imunocomprometidos com patologias hematológicas submetidos a quimioterapia ou a transplantes de medula ou de órgãos sólidos, e pacientes submetidos a sessões de hemodiálise também exibem uma alta prevalência de Criptosporidiose. Apresentam, igualmente, elevado risco de infeção por Cryptosporidium, os pacientes com imunodeficiências primárias de entre as quais podemos realçar: as imunodeficiências combinadas; deficiências de anticorpos; deficiências do sistema de complemento e deficiências no número e função dos fagócitos [38].

Nos pacientes imunocomprometidos com alterações na imunidade humoral ou celular estão descritos episódios de diarreia aquosa prolongada [36].

A Criptosporidiose é mais prevalente nos pacientes portadores de HIV, em particular naqueles em que se verifica uma diminuição de linfócitos T CD4+ e nos que apresentam comportamentos sexuais de alto risco [38].

Nos pacientes com HIV, a diarreia pode tornar-se “fulminante”, excreção de mais de 2 litros de fezes por dia, valores semelhantes aos registados em pacientes com cólera [36]. Valores de linfócitos T CD4+ inferiores a 200/mm3 colocam o indivíduo em risco elevado de infeção prolongada por Cryptosporidium; valores inferiores a 100/mm3 podem desencadear episódios de diarreia aguda prolongada podendo mesmo serem fatais [16].

No entanto, muitos estudos referem que existem algumas diferenças relativamente às manifestações clínicas entre indivíduos afetados e indivíduos com uma diminuição no número de linfócitos CD4+ que podem exibir apenas episódios de diarreia transitória [16]. No entanto, é de realçar que a infeção por Cryptosporidium aumenta a taxa de mortalidade nos pacientes com HIV, quando comparados com pacientes não infetados, nos quais se registou uma diminuição nos valores de linfócitos T CD4+ [16]. Na literatura, é referido um estudo em que pacientes com HIV foram divididos em diferentes grupos, de acordo com a estado da infeção por Cryptosporidium: infeção assintomática; infeção transitória; infeção crónica ou fulminante. Neste, verificou-se que a maioria dos pacientes apresentava infeção crónica ou fulminante e que neste grupo todos tinham valores de linfócitos T

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CD4+ muito baixos e, simultaneamente, eram os que tinham o tempo de vida mais curto [16]. Concluiu-se com este estudo que, apesar de nos pacientes imunocomprometidos a infeção por Cryptosporidium poder ser assintomática, transitória ou permanente, na maioria dos casos, esta é crónica podendo inclusive ser fatal.

2.7.2 Patofisiologia

2.7.2.1 Humanos e animais

Ainda não se encontram comprovados os mecanismos pelos quais o Cryptosporidium provoca a diarreia nos indivíduos imunocompetentes e imunocomprometidos. Contudo a literatura refere três possíveis mecanismos [16]:

- Má absorção resultante da diarreia osmótica;

- Produção de produtos inflamatórios e neuro-humorais;

- Produção de endotoxinas pelo parasita que leva à diarreia secretora.

Os perfis absortivos ou secretores variam de acordo com a região do trato gastrointestinal afetado. Nos indivíduos imunocompetentes a infeção por Cryptosporidium dá-se principalmente a nível do intestino delgado, mais concretamente a nível do íleo, sendo a sua distribuição mais complexa quando falamos dos indivíduos imunocomprometidos [16].

Segundo alguns estudos, a má absorção registada nos indivíduos portadores de HIV infetados por Cryptosporidium é explicada por uma diminuição da absorção da vitamina B12 e da D-xilose. Ainda segundo estes estudos, existe uma correlação entre a virulência do parasita e a má absorção, conjuntamente com a atrofia das vilosidades, ou seja, quanto maior for a virulência do parasita, maior será o grau de má absorção e atrofia das vilosidades [16].

Estudos radiológicos do intestino e estômago, efetuados em indivíduos portadores de HIV infetados por Cryptosporidium, também demostraram resultados consistentes com má absorção, como, por exemplo, um aumento do espessamento da parede da mucosa, dilatação do intestino delgado, floculação do bário [39].

Estudos que referem a ocorrência de episódios de diarreia líquida e volumosa em indivíduos imunocomprometidos sugerem o envolvimento de uma endotoxina ou

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de um produto neuro-humoral provocado pelo parasita [36]. No entanto, os investigadores ainda não conseguiram identificar essa toxina [36]. Estudos realizados em humanos infetados com Criptosporidiose, sugerem que parte da sintomatologia é devida a uma má absorção posterior à inflamação das vilosidades intestinais [36].

É também referido na literatura que o Interferon gama (IFN-) está envolvido no desenvolvimento do epitélio disfuncional através da sua ação nas trocas de iões sódio/hidrogénio e na bomba de sódio potássio ATPase [40]. Estudos in vivo e em humanos confirmam o papel das citocinas e das células inflamatórias detetando-se a presença do fator de necrose tumoral (TNF), interleucina 8 (IL-8) e lactoferrina (em crianças subnutridas), no decorrer da infeção por Cryptosporidium [41-43]

Estudos in vitro demostraram os efeitos nocivos do Cryptosporidium incluindo perda da integridade da barreira (aumento da resistência transepitelial) e dano da célula epitelial. Estas observações estão de acordo com aumento da excreção de manitol e lactulose registada em crianças/adultos com Criptosporidiose [44, 45].

A literatura refere igualmente, que os efeitos citopáticos provocados pelo C. parvum, nas células intestinais e biliares, poderão estar associados à apoptose induzida pela ativação das caspases [46] ou do Fas-ligando [47]. (A ativação do NFKB em células infetadas, inibiria a apoptose nas células intestinais e biliares adjacentes, possibilitando assim a sobrevivência do parasita e persistência da infeção)[48].

Estudos realizados em ratinhos referem alterações no transporte de glicose- sódio, assim como, na absorção de aminoácidos durante o período da infeção por Cryptosporidium [49, 50]. Além disso, o mesmo estudo refere que a má absorção dos aminoácidos persistia para além da clearance da infeção [51].

Através de estudos realizados em animais imunodeficientes, e envolvendo cultura de células, foram demonstradas características comuns numa infeção intestinal por Cryptosporidium, nomeadamente: atrofia das vilosidades; hiperplasia das criptas; infiltração da lâmina própria; secreção de cloreto; malabsorção da glucose [16]. Algumas destas alterações podem ser devidas à libertação de quimiocinas e citocinas (como o TNF-α e IFN-), produzidas por células inflamatórias da lâmina própria e por células da mucosa epitelial, durante a infeção por Cryptosporidium. O TNF-α e o IFN-são responsáveis pelo aumento da

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permeabilidade da mucosa [16], enquanto o TNF- aumenta o transporte de aniões nos enterócitos, através de um mecanismo mediado pelas prostaglandinas.

Há igualmente estudos que referem que um neuropéptido, denominado de substância P (SP), pode exercer um papel relevante durante a diarreia observada na Criptosporidiose [16]. São descritos estudos, em amostras do jejuno de macacos infetados com C. parvum, que revelaram um aumento da SP, que no trato intestinal estimula a secreção de cloreto [52].

Experiências realizadas em animais, fazem alusão a níveis de secreção basal de iões elevados, assim como, má absorção de glicose [52]. Os estudos focados anteriormente, estão de acordo com outros que já tinham sido realizados, e que demostraram existir uma maior expressão do RNA mensageiro (mRNA) da SP, tal como da expressão proteica, em amostras jejunais de pacientes sintomáticos com HIV e infetados por Cryptosporidium, quando comparados com indivíduos saudáveis imunocompetentes com infeção autolimitada [53].

A análise da expressão de genes nas células epiteliais do hospedeiro infetado por C. parvum indica que os genes para as citocinas proinflamatórias (IL-8, RANTES e SCYB5) e os que regulam a estrutura do citoesqueleto estão sobrereguladas durante a infeção. Os genes relacionados com a proliferação celular e com a apoptose apresentavam regulação variável. Estes efeitos sugerem que a infeção por C. parvum modifica as vias bioquímicas do hospedeiro, por alteração da expressão de genes [31].

Vários estudos, realizados em ratinhos com Síndrome de Imunodeficiência Combinada (SCID) relacionam a infeção de certas estirpes C. parvum com o desenvolvimento de adenocarcinoma biliar e gastrointestinal invasivo [54-56].

E ainda, estudos realizados com linhas celulares HCT-8 (Adenocarcinoma Ileocecal) mostram que C. parvum dependendo da sua fase de desenvolvimento, pode inibir (fase trofozoito) ou promover (fase de esporozoíto e merozoito) a apoptose da célula hospedeira, sugerindo que o parasita pode interatuar e regular a expressão de genes no hospedeiro [57].

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2.7.3 Tratamento

A literatura refere que a nitazoxanida é o único fármaco, aprovado pela Food and Drug Administration (FDA), utilizado no tratamento da Criptosporidiose, apenas nas crianças imunocompetentes e em pacientes adultos [16].

Em alguns casos de pacientes imunocomprometidos a literatura refere que têm sido utilizados vários fármacos, entre os quais sinefungina, azitromicina, paromomicina, roxitromicina e nitazoxanida, que levam a uma diminuição da frequência da diarreia, assim como a uma diminuição do volume das fezes. No entanto, a erradicação do parasita ainda não foi alcançada [16].

Registos clínicos de pacientes com coinfeção por HIV e Cryptosporidium, em que esta última infeção aparentemente teria desaparecido após a terapia retroviral, parece ressurgir, se o número de linfócitos T CD4+ diminuir, o que significaria que o parasita não foi totalmente erradicado. Segundo a literatura, um dos passos importantes para a erradicação da infeção é a reconstituição da resposta imune.

Também é referido que se conseguiu aumentar a eficácia do tratamento nos pacientes imunocomprometidos, combinando a nitazoxanida com a terapêutica antirretroviral altamente ativa (HAART). Isto verifica-se, devido ao efeito exercido pelos inibidores aspartil protéase antirretrovirais no ciclo de vida do parasita, assim como à reconstituição da resposta humoral [16].

A literatura refere algumas razões que contribuíram para que ainda não se tivesse conseguido a síntese de um fármaco eficaz. Essas razões estão relacionadas com a variedade das fases do Cryptosporidium, assim como a localização única do vacúolo parasitóforo [16].

2.8 Diagnóstico laboratorial

Na atualidade, para o diagnóstico de Criptosporidiose, são utilizados vários métodos: métodos microscópicos (o exame das fezes para identificar a presença de oocistos), métodos imunológicos (deteção de antigénios ou de anticorpos) e métodos moleculares, por exemplo, extracção de DNA genómico e amplificação por reação em cadeia de polimerase (PCR).

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O uso de cada método tem um objetivo, mas há também vantagens e desvantagens. Se o objetivo é identificar o parasitismo por Cryptosporidium sp., os métodos diretos de exame parasitológico de fezes e colorações especiais de esfregaços de fezes são suficientes. Por outro lado, se se pretende saber se o hospedeiro alguma vez foi exposto ao protozoário, então deverão ser utilizados métodos serológicos. Para distinguir as diferentes espécies de Cryptosporidium e estudos de genotipagem, são utilizadas as técnicas moleculares. Para diferenciar C. parvum de C. hominis, utiliza-se o método de PCR.

2.8.1 Métodos Diretos

2.8.1.1 Nas fezes

A maioria das infeções é diagnosticada por exame microscópico do material fecal para pesquisa de oocistos de Cryptosporidium [58], após terem sido utilizados métodos de concentração por centrifugação. Para a visualização dos oocistos, após concentração, são utilizadas técnicas de coloração especiais, como acid-fast modificada (Ziehl-Neelsen modificado a frio) ou coloração de Kinyoun (dimetil sulfóxido (DMSO) com carbol-fucsina, a frio), que coram os oocistos de vermelho e o corante de contraste como cor de fundo.

A _B

Figura 5 (A e B): Oocistos de C. parvum corados com a coloração de Acid-Fast modificada. Oocistos corados de vermelho, num fundo azul-esverdeado.

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Realizar o diagnóstico de Criptosporidiose por meio da microscopia não é simples. Além de depender de um microscopista bem treinado, é um método trabalhoso, cansativo e relativamente demorado. O profissional pode, às vezes, diagnosticar infeções equivocadamente ou não diagnosticá-las pois, a morfologia do oocisto é incerta. Este método não é útil para avaliar amostras submetidas a condições desfavoráveis, como as amostras ambientais, que podem modificar a morfologia do parasita [58]. Todavia, embora úteis para deteção de oocistos, os métodos parasitológicos têm a desvantagem de não permitir a identificação de espécies de Cryptosporidium.

Uma vez que, na maioria dos doentes, as amostras de fezes contêm grande número de oocistos e antigénios de Cryptosporidium, o resultado providenciado pelas técnicas imunológicas e de coloração de rotina deve ser positivo.

Nos pacientes com um número de oocistos baixo, os métodos convencionais utilizados na deteção dos oocistos são pouco sensíveis, uma vez que, podem passar despercebidos. Por outro lado, os métodos de centrifugação são os mais adequados para a concentração dos oocistos de Cryptosporidium e, mesmo após a realização destes, ainda é possível a identificação dos mesmos nas fezes.

A literatura também refere que pode não ser possível identificar os oocistos em todos os casos de Criptosporidiose, e, nos casos sintomáticos, a ausência de oocistos, não implica necessariamente a ausência de infeção. Nestes casos, as amostras fecais negativas devem ser submetidas aos métodos baseados na pesquisa de antigénios ou métodos de PCR, uma vez que, nas fezes, deve haver quantidade suficiente de antigénio e DNA. [59]

2.8.1.2 Na água

O diagnóstico do Cryptosporidium pode ser alargado a outros tipos de amostra como a água e os alimentos. Da mesma forma que foi citado anteriormente, há necessidade do método de concentração, seguindo-se neste caso, métodos de separação por gradiente de densidade ou separação utilizando pérolas imunomagnéticas. A taxa de recuperação dos oocistos é afetada por fatores como a turbidez, reatividade de anticorpos com outros microrganismos, remoção dos filtros, e perda durante a centrifugação.

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Devido às reduzidas dimensões e, por vezes, à sua escassez nas amostras de água, a deteção de oocistos do Cryptosporidium torna-se difícil. Por isso, torna-se importante otimizar as técnicas convencionais de monotorização de oocistos nas águas superficiais e de consumo. Atualmente, os métodos mais utilizados baseiam- se em 4 etapas fundamentais [12]: 1) Filtração mecânica de pequenos/ grandes volumes (1-1000 litros), de modo a maximizar a recuperação de oocistos e, assegurando assim, uma amostra representativa. Os volumes de água são filtrados através de filtros; 2) Purificação e concentração dos ocistos por separação imunomagnética (IMS) em que as partículas magnéticas estão ligadas a anticorpos específicos para antigénios dos oocistos; 3) Coloração com anticorpos monoclonais específicos fluorescentes; 4) Contagem dos oocistos usando a microscopia de fluorescência e microscopia de contraste de fase [12].

Na literatura, é referido que na etapa de purificação dos oocistos podem também ser utilizadas outras técnicas nomeadamente técnica de gradiente de densidade, centrifugação usando uma solução salina saturada, centrifugação de fluxo contínuo e citometria de fluxo [12].

Até 1998, o método recomendado pela USPA para analisar a presença de protozoários nas águas era o ICR (Information Collection Rule). No entanto, este método revelava-se pouco preciso e apresentava algumas desvantagens, como a baixa taxa de recuperação e uma elevada taxa de falsos positivos e negativos [60].

A IMS tem como objetivo separar os oocistos da matéria orgânica presente na amostra, utilizando uma barra magnética, o que permite uma melhor purificação da amostra [60].

Na IMS os epítopos dos oocistos ligam-se a pérolas magnéticas, revestidas por anticorpos monoclonais, que reconhecem a proteína da parede do oocisto. O complexo oocisto-pérolas é concentrado em suspensão, através da aplicação da força magnética de um íman que atrai este complexo para a parede do tubo de ensaio. O íman mantém os oocistos no seu lugar e o resto da suspensão é removido por aspiração [59]. O complexo oocisto-pérolas é então submetido a uma dissociação térmica, libertando os oocistos para análise.

As partículas paramagnéticas de magnetita revestidas com anticorpos apresentam determinadas vantagens nomeadamente, o seu pequeno tamanho e a relação área de superfície/volume destas partículas que permite um número elevado

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de locais de ligação ao anticorpo, originando, teoricamente, partículas muito reativas [59].

A IMS apresenta algumas desvantagens, particularmente em termos de custo e de tempo, sendo utilizada em estudos epidemiológicos e na investigação. Este método melhorou, significativamente, a identificação e a quantificação dos oocistos do Cryptosporidium [60].

Devido a um aumento de surtos atribuídos ao Cryptosporidium, a EPA implementou um método para análise dos protozoários nas águas- método 1622. Mais tarde, desenvolveu o método 1623 para deteção de Cryptosporidium e Giardia [60]. Este é o método de referência para determinar a concentração de Cryptosporidium em amostras de água bruta ou tratada [61]. A este método foi acrescentada uma etapa de separação imunomagnética.

Segundo a literatura, o método 1623 é considerado vantajoso, uma vez que embora tenha uma taxa de recuperação relativamente baixa, a faixa de variação é mais estável, sendo utilizado em vários países onde é obrigatório o rastreio de protozoários patogénicos, nas águas destinadas ao consumo público. É, também, a técnica mais adequada para a deteção de protozoários em amostras de água, quando utilizada em conjunto com as técnicas de biologia molecular, como o PCR. A literatura refere que se adicionou ao método 1623 o Sistema Filta-Max, que permitiu aumentar a concentração e recuperação dos oocistos de Cryptosporidium, em amostras de água bruta e tratada [60].

Está descrito na literatura que o método 1623, apesar de ser um dos métodos mais evoluídos para separação e deteção de Cryptosporidium, ainda não é capaz de identificar as espécies, nem determina a viabilidade e infeciosidade dos oocistos [62].

2.9 Métodos Indiretos

Alguns métodos imunológicos são utilizados para a identificação e quantificação de antigénios de protozoários, em amostras fecais, e para estudos epidemiológicos. Se o resultado for negativo, confirma-se a real ausência de oocistos. Atualmente, estes métodos são usados no rastreio de amostras em número elevado, antes da

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confirmação através da microscopia, como por exemplo, na pesquisa de oocistos de Cryptosporidium nas águas brutas e de consumo, para controlo de qualidade.

As técnicas imunológicas utilizadas fazem uso de anticorpos poli e monoclonais marcados com fluoresceína, contra antigénios de membrana da fase de oocisto.

Para além dos métodos referidos existe também a serologia baseada na deteção de imunoglobulinas por IF ou ELISA.

As técnicas referidas apresentam algumas vantagens em relação à microscopia para a deteção de oocistos de Cryptosporidium sp. e, ao diagnóstico da Criptosporidiose. Poderemos exemplificar referindo que a utilização de imunofluorescência direta com um anticorpo monoclonal anti-Cryptosporidium sp. apresenta elevada especificidade (96 – 100%) e sensibilidade (98,5 – 100%) para a deteção de oocistos de Cryptosporidium sp. em esfregaços fecais e amostras ambientais [58].

A deteção de antigénios nas amostras fecais (coproantigénios) é realizada através de imunoensaios como o Ensaio de Imunoabsorção Enzimática - (ELISA) ou ensaios imunocromatográficos. A especificidade destes é igualmente elevada (98 – 100%), no entanto, a sensibilidade para a deteção de coproantigénios pode ser mais baixa do que a maioria dos exames microscópicos. As vantagens que a pesquisa de coproantigénios apresenta em relação à microscopia é que estes podem detetar infeções pré-patentes em animais que não estejam a excretar oocistos nas fezes, podendo ser utilizados para triagem rápida, e sendo eficazes para trabalhar numerosas amostras [58].

Resumindo, para o diagnóstico de primeira linha da criptosporidose é utilizado o