O tratamento com as dCTMs + SD modula a

A interação das CTMs com as células residentes no ambiente da lesão, e especificamente os seus efeitos no fenótipo e na ativação destas células, vem sendo estudada, mas ainda continua incerta. No entanto, sabe- se que esta interação pode modular a liberação de moléculas mediadoras pelas células residentes. Neste trabalho, foi analisada a expressão gênica de fatores relacionados com o reparo da pele, comparando a diferença na expressão entre o grupo tratado com dCTMs + SD e o controle (somente SD) após 3, 7 e 14 dias pós-operatório. No dia 14 muitos genes não foram expressos, incluindo o padrão interno, o que pode indicar algum problema metodológico. Em razão disso, os resultados obtidos nesse período não foram discutidos, fazendo-se necessária a repetição desse ponto experimental.

As análises da expressão gênica indicam que o tratamento com dCTMs + SD modula a expressão de diferentes genes relacionados com o reparo tecidual na área lesionada. Estudos tem demonstrado que o tratamento com CTMs suprime a rápida expressão do RNAm de citocinas e fatores pró-inflamatórios (como IL-6, IL-1 e TNF), e aumenta a expressão de interleucinas anti-inflamatórias (como IL-10 e 4) no estágio inicial da

inflamação (YEUM et al., 2013). Contrariamente, neste estudo foi observado um aumento na expressão de IL-6 e TNF no grupo tratado com dCTMs + SD. Este aumento nas citocinas e fatores pró-inflamatórios pode estar relacionado com o maior recrutamento de células inflamatórias nos animais tratados com dCTMs + SD (observadas através de análise histológica). Porém, a expressão do RNAm de IL-10, uma importante molécula anti-inflamatória, também foi upregulated no grupo dCTMs + SD, podendo estar envolvida com a resolução da inflamação.

Bunnell e colaboradores (2010) têm relatado que as CTMs secretam uma variedade de fatores pró-inflamatórios e anti-inflamatórios que afetam inúmeros processos, como apoptose, angiogênese e inflamação. Este grupo tem definido um mecanismo pelo qual as CTMs podem ter fenótipos distintos, conforme a sinalização molecular: um fenótipo pró-inflamatório nas fases iniciais da lesão e anti-inflamatório em fases mais tardias (BUNNELL; BETANCOURT; SULLIVAN, 2010). Estes dados indicam que os mecanismos pelos quais as CTMs atuam na fase inflamatória são complexos, e mais estudos são necessários para compreender sua ação.

Em relação aos fatores de crescimentos importantes durante a fase proliferativa, a grande maioria dos genes no grupo dCTMs + SD foram upregulated no dia 3, mas não variaram ou diminuíram sua expressão no dia 7. O RNAm do EGF foi o único upregulated nos dois dias analisados. O aumento na expressão do RNAm destes fatores, principalmente FGF, EGF, KGF e VEGF, nas fases iniciais do reparo pode estar relacionada com a maior vascularização, depósito de matriz extracelular e re-epitelização observadas no grupo tratado com dCTMs + SD.

A expressão do RNAm das proteínas de matriz extracelular, colágeno IaI e colágeno III, foi regulada de forma distinta no grupo dCTM + SD. Enquanto a expressão de colágeno III foi altamente dowregulated, a de colágeno IaI aumentou. Estes dados são consistentes com o maior depósito de colágeno I observado através das análises imunohistoquímicas no grupo tratado com dCTMs + SD. Apesar da expressão de colágeno III não ter sido avaliada por imunohistoquímica, pode-se sugerir que esta diminuição na expressão do seu RNAm ocorre pelo amadurecimento da matriz extracelular, que inclui a substituição do depósito inicial de colágeno III pelo colágeno I (JANIS; KWON; LALONDE, 2010; RADKE; TELLER; WHITE, 2009).

A diferenciação de fibroblastos em miofibroblastos na área lesionada está relacionada à maior contração da ferida (RADKE; TELLER; WHITE, 2009). Neste trabalho, foi avaliada a expressão do RNAm de α-SMA, marcador de miofibroblastos, e os resultados obtidos revelaram que no grupo tratado com dCTM + SD a sua expressão aumentou no dia 3, mas no

dia 7 foi altamente downregulated. A diminuição no dia 7 pode indicar menor diferenciação e presença deste fenótipo na lesão tratada com dCTM + SD, e consequentemente melhor cicatrização da ferida. A diminuição da expressão do RNAm de TGF-β, no dia 7, pode estar relacionada com esta diminuição na expressão de α-SMA, já que esse fator de crescimento possui papel chave na diferenciação de fibroblastos em miofibroblastos.

A expressão gênica das metaloproteases e seu inibidor, TIMP-1, no grupo tratado com dCTM + SD aumentou no dia 3, mas foi downregulated no dia 7. Estes resultados são coerentes, pois a expressão do RNAm das MMP pode regular a expressão do RNAm do seu inibidor, neste caso do TIMP-1. Além disso, a análise imunohistoquímica revelou um maior depósito de matriz extracelular no grupo dCTM + SD, nos dias 7 e 14, indicando uma menor atividade de MMP. No entanto, espera-se um aumento destas proteínas nas fases finais do reparo, não analisado neste estudo, já que foi observado que após 21 dias a cicatriz formada no grupo tratado com dCTMs + SD é mais organizada e delgada que no grupo controle.

Os resultados referentes à expressão gênica, mostradas neste estudo, confirmam que as células no ambiente da lesão são moduladas pelo tratamento com dCTMs + SD. Nesse sentido, levanta-se a pergunta: quais células tiveram sua expressão alterada no ambiente da lesão? Entre os genes analisados, alguns são expressos por fibroblastos, queratinócitos, macrófagos, neutrófilos e células endoteliais. Porém, os dados analisados neste estudo não permitem responder com exatidão a esta pergunta. Estudos recentes têm relacionado o efeito das CTMs com a regulação de macrófagos (CHEN et al., 2008; ZHANG et al., 2010). Neste sentido, as CTMs promovem a ativação dessas células, modificando seu fenótipo e ocasionando a secreção de vários fatores modulatórios, que recrutam e modificam a atividade de outros tipos celulares. Assim, os macrófagos influenciam a resolução da inflamação e atuam na fase proliferativa e de remodelamento (ZHANG et al., 2010). Em um estudo in vitro, foi observado que macrófagos humanos após co-cultivo com CTMs adquiriram um fenótipo caracterizado pela alta expressão de IL-6 e IL-10, quando comparada ao controle (MAGGINI et al., 2010). Em um modelo de isquemia, o efeito neuroprotetivo das CTMs foi explicado pela ativação de macrófagos no sistema nervoso central (OHTAKI et al., 2008). Fibroblastos, queratinócitos e células endoteliais são estimuladas pelos macrófagos durante a fase proliferativa e induzem a formação da matriz extracelular, re-epitelização e neovascularização. Subsequentemente, os macrófagos podem alterar a composição da matriz extracelular durante a

fase de remodelamento pela liberação de enzimas proteolíticas (MAHDAVIAN DELAVARY et al., 2011; SHARMA; SNEDEKER, 2012). Estes dados sugerem que a ação das CTMs na modulação da expressão gênica e, consequentemente, na atividade dos macrófagos seria um passo crucial para o efeito reparador atribuído as CTMs.

Em resumo, os resultado experimentais obtidos no presente trabalho fornecem fortes evidências de que a presença das dCTMs na lesão está envolvida com o reparo tecidual mais efetivo (Figura 28). Pode-se afirmar, assim, que este estudo apresentou um método efetivo e viável de tratamento de lesões cutâneas através da associação de dCTMs com substitutos dérmicos, fornecendo um promissor tratamento para o reparo tecidual.

Figura 28. Esquema representativo da ação das dCTMs + SD nas lesões cutâneas, demonstradas neste estudos.

Os resultados deste estudo sugerem que o tratamento de lesões cutâneas com dCTMs associadas ao SD resultou no reparo tecidual mais eficiente, por promover uma maior vascularização, re-epitelização, depósito de MEC e recrutamento de macrófagos e neutrófilos na lesão. A inibição da diferenciação de fibroblastos para miofibroblastos pode ter ocasionado uma menor contratura da lesão. Além disso, as dCTMs podem ter uma ação direta no reparo tecidual, pela sua diferenciação em fenótipos presentes na lesão, como queratinócitos, fibroblastos e células endoteliais.