Tratamento e Controle

Na Índia o tratamento de animais baseado nos sinais clínicos é bastante comum, o que favorece a resistência aos tripanocidas disponíveis atualmente (SINGH; SHYMA; GUPTA, 2014). Quinapiramina, suramina,melarsomina e cymelarsan são os principais compostos utilizados no tratamento do T.evansi em equinos, camelos e búfalos (PEREGRINE, 1994).

Quinapiramina e suramina são os princípios mais utilizados na China, porém o fácil acesso, devido ao preço baixo, e o uso incorreto estão levando ao aparecimento de resistência a esse fármaco (LIAO; SHEN, 2010).Há muito tempo esses compostos vêm sendo utilizado, isso reforça a importância da descoberta de novos alvos, para que novas opções de medicamentos possam ser utilizados.

No Brasil o príncípio químico utilizado no tratamento da Surra é o aceturato de diminazeno (SILVA, 2002) o mesmo princípio também se mostrou eficiente no tratamento de equinos e mulas infectadas com T. evansi na Tailândia (TUNTASUVAN et al., 2003).

Devido à falta de vacina contra tripanossomas, o controle da doença baseia-se principalmente sobre o uso de tripanocidas e métodos preventivos para proteger os

animais contra a infecção (DESQUESNES et al., 2013).

Silva et al. (2002) relata que durante décadas vários métodos de controle, tais como desmatamento, uso de machos estéreis e armadilhas impregnadas com inseticidas para o controle dos vetores, pulverização de inseticidas nos animais, na vegetação, uso de inseticidas pouron e quimioprofilaxia foram tentados na África. Porém atualmente apenas a quimioprofilaxia e o controle dos vetores com drogas pouron e armadilhas impregnadas com inseticidas continuam sendo usadas.

É necessário que novas metodologias de controle, tratamento e diagnóstico sejam descobertos, para isso muitas pesquisas estão em desenvolvimento. O estudo das proteínas de membrana do T.evansi visa identificar alguma proteína que seja vital para o agente no desenvolvimento da doença e específico do T.evansi para que possamos utilizar esse alvo como futuro alvo terapêutico e diagnóstico.

1.3 PROTEÔMICA

O termo proteômica engloba um conjunto de técnicas que nos permite estudar de uma forma mais abrangente as proteínas, as quais apresentam uma incrível diversidade de propriedades químicas, com uma ampla gama de atividade catalítica, peso molecular e solubilidade (MCDONALD; YATES, 2002).

Atualmente apenas um trabalho foi publicado a respeito de proteômica do T.evansi. Resumidamente, neste trabalho os autores coletaram o sangue de um camelo infectado e inocularam em um camundongo. Após obter uma alta parasitemia coletaram o sangue do animal e purificaram os parasitos, os quais foram lisados e realizado a extração das proteínas. Foi então feita a

técnica de SDS-PAGE, onde foi possível visualizar diferentes bandas de proteínas. O gel foi dividido em diversas fatias e realizado a digestão com o uso de tripsina. O produto dessa digestão foi analisado por RPLC seguido de espectrometria de massa. Neste trabalho foram identificadas166 proteínas do extrato total envolvidas em diferentes processos metabólicos.

Avaliando a solubilidade das proteínas, algumas foram classificadas como proteínas ligadas a membrana (ROY et al., 2010).

As proteínas integrais de membrana estão entre as proteínas mais importantes dentro de uma célula, devido à sua forte implicação na sobrevivência celular. Elas representam um terço das proteínas codificadas pelo genoma humano, e são muitas vezes sub-representadas em perfis proteômicos(SANTONI; MOLLOY;

RABILLOUD, 2000). A escolha deste grupo de proteínas como ferramenta de trabalho está relacionada com as inúmeras funções que exercem como: a comunicação com células de ambiente externo, regulam o reconhecimento da resposta imune, atuam como alvo para a maioria das drogas farmacêuticas, responsáveis pela adesão celular nos tecidos e atuam no controle de processos metabólicos (GILMORE; WASHBURN, 2010).

Uma característica desse grupo de proteína é sua natureza anfipática (com regiões hidrofílicas e hidrofóbicas) com diferentes cadeias de peptídeos que passam através da membrana (SPEERS; WU, 2007).

1.3.1Glicosilfosfatidilinositóis (GPIs)

Apesar do T. evansi ser conhecido há mais de 120 anos, existe pouca informação sobre o isolamento e caracterização de proteínas específicas e de moléculas ancoradas desse parasito.

Os tripanossomas africanos, tais como o T. evansi possuem na parte externa de sua membrana plasmática uma cobertura de 10-15 nm de espessura de glicoproteínas, que diferem em estrutura conforme a população do parasita. Estas VSGs (glicoproteínas variantes de superfície) estão inseridas na membrana através de âncoras de GPI e são responsáveis pelas variações antigênicas observadas na infecção pelo parasito (RICHARDS, 1984). As variações antigênicas são explicadas também pela condição epizootiológica, a espécie do hospedeiro e outros fatores relacionados ao animal como outras infecções, estresse e subnutrição (MATHUR, 1972; JONES, 1985). A ancoragem de moléculas nas membranas biológicas por GPIs é uma modificação pós-traducional onipresente em proteínas tanto em eucariotos inferiores como superiores (MCCONVILLE; FERGUSON, 1993). Em mamíferos, a biossíntese de GPI é vital para o desenvolvimento embrionário, e proteínas ancoradas por GPI participam de importantes processos biológicos, tais como as interações célula-célula, transdução de sinal, endocitose, regulação do sistema complemento e apresentação antigênica (MCCONVILLE; FERGUSON, 1993; ORLEAN; MENON, 2007; PAULICK; BERTOZZI, 2008).

Em eucariotos inferiores, especialmente leveduras e protozoários, moléculas ancoradas por GPI, também demonstraram ter importância em várias funções biológicas (FERGUSON, 1999; MCCONVILLE; MENON, 2000; ORLEAN; MENON, 2007). Em protozoários

patogênicos (Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei, Leishmania major e Plasmodium falciparum), por exemplo, glicoconjugados ancorados por GPI, recobrem a membrana plasmática estando envolvidos em muitos aspectos da interação hospedeiro-parasito, tais como a adesão e invasão das células hospedeiras, modulação e evasão da resposta imune do hospedeiro e patogênese (MCCONVILLE; FERGUSON, 1993; FERGUSON, 1999;

MCCONVILLE; MENON, 2000; ALMEIDA et al., 2000;

BUSCAGLIAet al., 2006; GAZZINELLI; DENKERS, 2006;

ACOSTA-SERRANO et al., 2007).

A estrutura geral de uma âncora GPI é composta por uma cauda lipídica contendo fosfatidilinositol (PI) ou inositolfosforilceramida (IPC), ligada a um núcleo de carboidratos constituído por uma glicosamina (GlcN) seguida de três resíduos de manose (Man). Ligada à terceira manose distal da glicosamina, geralmente um resíduo de etanolaminafosfato (EtNP) liga a GPI com a parte C-terminal da proteína. Outras modificações da âncora podem ocorrer, tais como, inserção de resíduos extras de carboidratos, inserção de resíduos de EtNP e/ou aminoetilfosfonato (AEP), substituição do núcleo de carboidratos e/ou presença de um ácido graxo adicional ligado ao anel de mio-inositol, aumentando a complexidade da estrutura de GPI (FERGUSON, 1999;

MCCONVILLE; FERGUSON, 1993). A estrutura da âncora de GPI está apresentada na figura 4.

Figura 4: Representação esquemática da estrutura da âncora de GPI.

Fonte: Ferguson, 1999; McConville; Ferguson, 1993.

Devido à sua estrutura complexa e a natureza anfifílica, GPIs e proteínas ancoradas por GPI são ligeiramente difíceis de ser extraídas, purificadas e totalmente caracterizadas. Recentemente, Nakayasuet al.

(2009), desenvolveram uma cromatografia de fase reversa com resina de poliestireno-divinilbenzeno (POROS R1) (DEPHILLIPS et al., 1994; WHITNEY et al., 1998), para purificar moléculas ancoradas por GPI e GPIs livre (GIPLs) de T. cruzi. Este passo cromatográfico foi acoplado ao espectrômetro de massa e usado para a análise dos GIPLs e GPIs liberadas por proteinases.

Como resultado demostraram que o GPIoma do T. cruzi é muito mais complexo do que se sabia anteriormente.

2 OBJETIVOS

 Identificar as proteínas presentes na fração enriquecida de membrana doT. evansi extraída com Triton X-114 utilizando a abordagem proteômica LC-ESI-MS/MS.

 Identificar proteínas alvos para marcadores de diagnóstico específico de T. evansi baseados no reconhecimento de antígenos de superfície, por anticorpo de T. evansi produzido em ratos e por análise proteômica.