CAPÍTULO 2: OBJETIVOS
3.5 DELINEAMENTO DO ESTUDO
3.5.2. Tratamento e grupos experimentais
Para determinação da eficácia dos nutracêuticos e posterior análise do uso associado, o protocolo experimental foi dividido conforme segue:
3.5.2.1. In vitro
Concentração de citocinas em microglias ativadas por LPS
Após o plaqueamento, as culturas de microglias foram co-tratadas durante 24 horas238 com LPS (Escherichia coli serotype 055:B5; 100 μg/mL) e ALA (200 µmol)239, ou LPS e OP (100 µmol)240, ou associados (LPS, ALA e OP, todos nas mesmas concentrações do uso isolado). Após o período, as células foram coletadas e processadas para as análises de determinação de citocinas usando kit comercial Bio-Plex Pro™ Rat Cytokine 23-Plex Assay (Bio-Rad Laboratories, CA, EUA), conforme as recomendações do fabricante. A análise foi realizada em um sistema Bio-Plex 200 e os resultados foram expressos em pg/mg de proteína.
3.5.2.2. In vivo
Experimento 1: Verificação do efeito isolado do ácido α-lipoico
Os grupos foram aleatoriamente divididos em: Sham+Sal, Sham+ALA, CLP+Sal e CLP+ALA. O ácido R-α-lipoico ≥99% (Lemma Suply Solutions, Brasil) foi ofertado via oral, por meio de gavagem, na dose de 200 mg/kg diluído em salina, totalizando 1 mL21. Para a realização das análises em 12 e 24 horas, a administração de ALA ocorreu imediatamente antes da anestesia, a fim de garantir a deglutição. Para a realização das análises em 10 dias, a administração de ALA foi realizada imediatamente antes da anestesia e 24 horas posteriores à cirurgia.
Para as análises bioquímicas, foram inseridos nos grupos experimentais sete animais em cada grupo Sham e 10 animais em cada grupo CLP, totalizando 34 animais em cada tempo avaliado (12 e 24 horas). Para a análise da permeabilidade da BHE, foram inseridos nos grupos experimentais sete animais em cada grupo Sham e 10 animais em cada grupo CLP, totalizando 34 animais. Para as análises de sobrevida e de testes comportamentais foram inseridos nos grupos experimentais 13 animais em cada grupo Sham e 20 animais em cada grupo CLP, totalizando 66 animais.
Experimento 2: Verificação do efeito isolado do óleo de peixe
Os grupos foram aleatoriamente divididos em: Sham+Sal, Sham+OP, CLP+Sal e CLP+OP. O óleo de peixe (Omegaven® 10%, Fresenius Kabi Brasil) foi ofertado via oral, por meio de gavagem, na dose de 600 µL/kg241. De acordo com o fabricante, esta dose ofertou de 0,0075 g a 0,0169 g de EPA e de 0,0086 g a 0,0185 g de DHA. Para a realização das análises em 24 horas, a administração de óleo de peixe ocorreu imediatamente antes da anestesia e 12 horas após a cirurgia. Para a realização das análises em 10 dias, a administração de óleo de peixe foi realizada diariamente e durou nove dias, começando imediatamente antes da anestesia.
Para as análises bioquímicas, foram inseridos nos grupos experimentais sete animais em cada grupo Sham e 10 animais em cada grupo CLP, totalizando 34 animais. Para a análise da permeabilidade da BHE, foram inseridos nos grupos experimentais sete animais em cada grupo Sham e 10 animais em cada grupo CLP, totalizando 34 animais. Para as análises de sobrevida e de testes comportamentais
foram inseridos nos grupos experimentais 13 animais em cada grupo Sham e 20 animais em cada grupo CLP, totalizando 66 animais.
Experimento 3: Verificação do efeito da associação de ácido α-lipoico e óleo de peixe
Os grupos foram aleatoriamente divididos em: Sham+Sal, CLP+Sal, CLP+ALA, CLP+OP e CLP+Assoc. O grupo CLP+Assoc recebeu o tratamento associado de ácido lipoico (na dose de 200 mg/kg diluído em salina, totalizando 1 mL21) e de óleo de peixe (na dose de 600 µL/kg241).
Para as análises bioquímicas, foram inseridos nos grupos experimentais sete animais em cada grupo Sham e 10 animais em cada grupo CLP, totalizando 47 animais. Para a análise da permeabilidade da BHE, foram inseridos nos grupos experimentais sete animais em cada grupo Sham e 10 animais em cada grupo CLP, totalizando 47 animais. Para as análises de sobrevida e de testes comportamentais foram inseridos nos grupos experimentais 13 animais em cada grupo Sham e 20 animais em cada grupo CLP, totalizando 87 animais.
Figura 6 – Metodologia do estudo in vivo.
Legenda: ALA ácido α-lipoico; Assoc associação; BHE barreira hematoencefálica; CLP ligação e perfuração cecal; Exp experimento; OP óleo de peixe; Sal salina. Fonte: elaborado pelo autor, 2018.
3.6 ANÁLISE DE SOBREVIDA
Na avaliação da sobrevida, 10 animais de cada grupo foram observados diariamente durante 10 dias após indução de sepse para verificar a taxa de mortalidade242.
3.7 ANÁLISES BIOQUÍMICAS
3.7.1 Coleta de amostras
Para coleta das amostras, os animais sofreram morte indolor assistida por overdose de tiopental (0,5 g/Kg) e decaptação por guilhotina para coleta das amostras biológicas. As estruturas cerebrais hipocampo, córtex pré-frontal e córtex total (tecido encefálico remanescente após retirada do hipocampo e córtex pré- frontal) foram cuidadosamente dissecadas, armazenadas em tubos do tipo Eppendorf e mantidas sob refrigeração em freezer -80 ºC até posterior análise.
3.7.2 Determinação de citocinas
As concentrações de TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-10 foram determinadas pelo ensaio imunoenzimático (ELISA), usando kits comerciais (Peprotech, Brasil). O ensaio foi realizado de acordo com as instruções do fabricante e a leitura foi realizada em 450 nm na leitora de microplacas (SPECTRAMAX, Molecular Devices, USA). Os resultados foram expressos em pg/mg de proteína.
3.7.3 Determinação de BDNF e NGF
Para o experimento em que o efeito isolado do ALA foi testado, as concentrações de BDNF e NGF13 foram determinadas pelo ensaio imunoenzimático (ELISA) sanduíche utilizando os kits ChemiKine™ Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF) e ChemiKine™ Nerve Growth Factor (NGF), seguindo as instruções do fabricante (ChemiKine™, Chemicon, EUA). As amostras foram homogeneizadas, diluídas em solução diluente na proporção de 1:2 e encubadas em placas de 96 micropoços por 24 horas. A curva padrão variando entre 7,8 a 500 pg de BDNF ou
NGF foi realizada. Posteriormente, as placas foram lavadas quatro vezes com solução diluente e encubadas durante três horas em temperatura ambiente com anticorpos monoclonais de coelho anti-BDNF e anti-NGF. Após nova lavagem, as placas foram novamente encubadas por uma hora com anticorpo anti-coelho conjugado com peroxidase diluído em 1:1000. Depois da adição do conjugado enzima-estreptavidina, substrato e solução de parada, a quantidade de BDNF ou NGF foi determinada em leitura no espectrofotômetro em 450 nm. Os resultados foram expressos em mBDNF ou m NGF/mg de proteína.
Para os experimentos em que foram testados os efeitos isolados do óleo de peixe e os efeitos da associação de ALA e óleo de peixe, as concentrações de BDNF foram determinadas pelo ensaio imunoenzimático (ELISA) sanduíche utilizando o kit Human/Mouse BDNF DuoSet ELISA (Cat. DY248), seguindo as instruções do fabricante (R&D Systems, EUA). As amostras foram homogeneizadas e manipuladas conforme a recomendação metodológica do fabricante. A sensibilidade do ensaio variou entre 23,4 e 1500 pg/mL e os valores obtidos foram estimados pela interpolação da curva padrão em um ensaio colorimétrico. A leitura foi realizada em um aparelho leitor de ELISA (Perlong DNM-9602, Nanjing Perlove Medical Equipment Co, Nanjing, China)243 em 450 nm (com correção em 540 nm). Os resultados foram expressos em pg/mg de proteína.