Tratamento estatístico

Os resultados obtidos foram tratados estatisticamente recorrendo ao programa estatístico Statistical Package for Social Scienses (SPSS) versão 13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL). Realizou-se o teste Kolmogorov-Smirnov para avaliar a normalidade dos dados. Como se verificou que os dados não obedeciam a uma distribuição normal, efectuaram-se testes não paramétricos: O teste Mann-Witney e o teste de Kruskal- Wallis. O teste de X2 de Pearson foi utilizado para a análise de dados qualitativos. As diferenças registadas são consideradas estatisticamente significativas para valores de p <0,05. As médias estão representadas na forma média ± desvio padrão.

Após a execução do PCR com recurso ao par de primers 5’CTGCACCCTATCTGTATCTTTTCCTATTCTCC3’ (primer forward) e 5’TCTTTCTCTGCCACCCTGGCGTCGATTATCTGA3’ (primer reverse) obteve-se, para cada amostra, um fragmento de 1374 pb facilmente identificável no gel de agarose (Figura 5).

Posteriormente, os fragmentos de 1374 pb amplificados foram submetidos à digestão com as enzimas Pvu II e Xba I originando diferentes perfis de bandeamento.

Na análise RFLP, os alelos do polimorfismo Pvu II foram definidos como T e C referindo-se, respectivamente, a presença e a ausência do local de restrição. Os genótipos dos locais polimórficos Pvu II (-397 T/C) foram caracterizados como CC, CT e TT (Figura 6). O homozigótico CC exibe um fragmento de 1374 pb, enquanto que o heterozigótico CT exibe fragmentos com 438 pb, 936 pb e 1374 pb, e a variante homozigótica TT produz fragmentos de 438 pb e 936 pb.

Os alelos do polimorfismo Xba I foram definidos como A e G referindo-se, respectivamente, a presença e a ausência do local de restrição (Figura 6). Os genótipos

Capítulo IV – Resultados

Figura 5. Produtos de PCR em gel de agarose a 1,5 %. Os produtos amplificados têm um

tamanho de 1374 pb.

Legenda:

M – marcador de peso molecular; CP – Controlo Positivo; CP – Controlo negativo; 1-6 – amostras em duplicado. O controlo positivo é uma amostra anteriormente amplificada e já visualizada em gel de agarose. O controlo negativo foi sujeito ao mesmo protocolo do que as amostras com a excepção de em vez de DNA conter ddH2O.

M CP ├ 1 ┤ ├ 2 ┤ ├ 3 ┤ ├ 4 ┤ ├ 5 ┤ ├ 6 ┤ CN

dos locais polimórficos Xba I (-351 A/G) foram caracterizados como GG, GA e AA. O homozigótico GG exibe um fragmento de 1374 pb, enquanto que o heterozigótico GA exibe fragmentos com 393 pb, 981 pb e 1374 pb, e a variante homozigótica AA produz fragmentos de 393 pb e 981 pb.

Estes dois polimorfismos estão separados apenas por 45 pb e a bibliografia refere que se encontram em desequilíbrio de ligação, ou seja, existem combinações alélicas que ocorrem com mais frequência do que seria esperado pela variabilidade aleatória (Herrington et al., 2002). As combinações alélicas em desequilíbrio de ligação designam-se de haplótipos. Neste trabalho, os haplótipos observados foram: CCGG, CCGA, CTGG, CTGA, CTAA, TTGA, TTAA. Não foram observados os haplótipo CCAA e TTGG. Na figura 7 podem observar-se os padrões electroforéticos dos haplótipos encontrados.

M

Pvu II Xba I

CC CT TT GG GA AA

Figura 6. Padrão de bandeamento de cada um dos genótipos dos polimorfismos Pvu II e Xba I. Legenda:

M - marcador de peso molecular; Pvu II – polimorfismo Pvu II; CC – homozigótico onde não ocorre digestão enzimática; CT – heterozigótico; TT – homozigótico onde ocorre digestão enzimática.

Xba I – polimorfismo Xba I GG – homozigótico onde não ocorre digestão enzimática; GA –

heterozigótico; AA – homozigótico onde ocorre digestão enzimática.

Os tamanho dos fragmentos apresentados foram obtidos através de pesquisas em bases de dados bioinformáticas, nomeadamente o NCBI/BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), o Ensembl (http://www.ensembl.org/Multi/Info/Index), o NEBcutter (http://tools.neb.com/NEBcutter2/) e o REBsites. (http://tools.neb.com/REBsites/index.php).

1374 pb 1374 pb

936 pb 981 pb

393 pb 438 pb

Na presença do haplótipo CCGG, a paciente é duplamente homozigótica e não apresenta restrição enzimática para os dois polimorfismos. Uma paciente que apresente um haplótipo CTGG é heterozigótica para o polimorfismo Pvu II e homozigótica GG para o polimorfismo Xba I. Quando se está na presença de um haplótipo CTGA, a paciente é duplamente heterozigótica para os dois polimorfismos. No caso do haplótipo ser CTAA, a paciente é heterozigótica para o polimorfismo Pvu II e homozigótica AA para o polimorfismo Xba I. O haplótipo TTGA caracteriza uma paciente homozigótica TT para o polimorfismo Pvu II e heterozigótica para o polimorfismo Xba I. Na presença do haplótipo TTAA, a paciente é duplamente homozigótica e apresenta restrição enzimática para os dois polimorfismos.

As frequências dos alelos, genótipos e haplótipos analisados neste estudo estão referenciadas na Tabela I. Esta análise foi efectuada através do teste de X2.

TT GA CCGG CC GA CTGA CTGA CTGA CTGA CTGA CCGA CCGG CTGA CTGA M├ 11 ┤├ 12 ┤├ 13 ┤├ 14 ┤├ 15 ┤├ 16 ┤ M ├ 17 ┤├ 18 ┤├ 19 ┤├ 20 ┤├ 21 ┤├ 22 ┤ sd P X sd P X sd P X sd P X sd P X sd P X sd P X sd P X sd P X sd P Xsd P X sd P X CT GA CC GG TT GA CT GA CTAA CTGA CCGA TTGA CTGG TTAA sd P X sd P X sd P X sd P X sd P X sd P X sd P X sd P X sd P X sd P X M ├ 1 ┤├ 2 ┤├ 3 ┤├ 4 ┤ M├ 5 ┤├ 6 ┤├ 7 ┤├ 8 ┤├ 9 ┤├ 10 ┤ A B D

Figura 7. Análise RFLP dos polimorfismos Pvu II e Xba I do gene ESR1. Legenda:

M – marcador de peso molecular utilizado; 1- 22 - amostras em triplicado de pacientes submetidas a estimulação da ovulação para técnicas de PMA; sd – amostras sujeitas a digestão enzimática. P – amostras digeridas com a enzima Pvu II; X – amostras digeridas com a enzima Xba I.

Como se pode verificar, não existem diferenças significativas na distribuição dos genótipos e dos haplótipos nos grupos controlo e experimental (ESR1 Pvu II p=0,974; ESR1 Xba I p= 0,719 e ESR1 Pvu II/ Xba I p= 0,873).

No grupo experimental, observaram-se sete haplótipos (CCGG, CCGA, CTGG, CTGA, CTAA, TTGA, TTAA) e apenas quatro no grupo controlo (CCGG, CTGA, TTGA, TTAA).

Tabela I. Frequências de genótipos e haplótipos dos polimorfismos Pvu II e Xba I no

grupo controlo e no grupo experimental.

Frequências Grupos

Controlo Experimental Controlo + Experimental

n= 12 n= 93 n= 105 ESR1 Pvu II CC 2 (16,7%) 17 (18,3%) 19(18,1%) CT 7 (58,3%) 51 (54,8%) 58 (55,2%) TT 3 (25,0%) 25 (26,9%) 28 (26,7%) a_p=0,974 C 45,8% 45,7% 45,7% T 54,2% 54,3% 54,3% ESR1 Xba I GG 2 (16,7%) 16 (17,2%) 18 (17,1%) GA 9 (75,0%) 61 (65,6%) 70 (66,7%) AA 1 (8,3%) 16 (17,2%) 17 (16,2%) b_p=0,719 G 54,2% 50% 49,5% A 45,8% 50% 50,5%

ESR1 Pvu II / Xba I

CCGA 0 (0%) 5 (5,4%) 5 (4,8%) CCGG 2 (16,7%) 11 (11,8%) 13 (12,4%) CTAA 0 (0%) 2 (2,2%) 2 (1,9%) CTGA 7 (58,3%) 45 (48,4%) 52 (49,5%) CTGG 0 (0%) 4 (4,3%) 4 (3,8%) TTAA 1 (8,3%) 15 (16,1%) 16 (15,2%) TTGA 2 (16,7%) 11 (11,8%) 13 (12,4%) c_{p= 0,873}

Os valores de p foram obtidos através da realização do teste de X2 de Pearson.

Os resultados são considerados estatisticamente significativos para valores de p <0,05, o que não se observou nos valores de p apresentados nesta tabela (ap, bp, cp).

Da análise dos processos clínicos recolheram-se dados relativos à causa de esterilidade, ao tipo de esterilidade e a alguns parâmetros do ciclo de estimulação efectuado.

Os parâmetros relativos ao ciclo de estimulação da ovulação avaliados foram os seguintes: número total de folículos; número de folículos com tamanho igual ou superior a 14 mm; doseamento de estradiol (E2); número total de ovócitos; número de ovócitos em metafase II; percentagem de ovócitos maduros (número de ovócitos em metáfase II sobre número total de ovócitos); número de embriões; e percentagem de clivagem (número de embriões sobre número de ovócitos em metáfase II). A contagem de folículos e o doseamento de estradiol foram efectuados no dia do desencadeamento da ovulação (administração de hCG).

Através do teste de Mann-Witney procurou-se verificar se existiam diferenças entre os grupos controlo e experimental em relação aos parâmetros dos ciclos de estimulação da ovulação efectuados. Todavia, apenas se encontraram diferenças estatisticamente significativas para o número total de folículos (Gráfico 1).

Enquanto que o grupo controlo apresenta uma média de número total de folículos de 8,19±4,45, o grupo experimental apresenta 12,21±7,82 (p= 0,011). O grupo controlo, que não tem qualquer factor de esterilidade feminina associado, quando foi submetido a estimulação originou um menor número folicular médio do que o grupo experimental que é constituído por mulheres com diferentes factores de esterilidade.

Gráfico 1. Média do número total de folículos no

dia de administração de hCG no grupo controlo e no grupo experimental. *p=0,011. O valor de p foi

Média do nº total de folículos no dia da administração da hCG 0 5 10 15 20 25

Grup o controlo Grupo exp erimental *

Relativamente à percentagem de ovócitos maduros (número de ovócitos em metáfase II sobre o número total de ovócitos), o grupo controlo apresenta uma maior percentagem de folículos maduros de 69,06% ± 27,58% do que o grupo experimental que apresenta uma percentagem de 58,59% ± 31,24%, embora estes valores não sejam estatisticamente diferentes (Gráfico 2, p= 0,078).

Ao relacionar os parâmetros de resposta à estimulação ovárica com os genótipos e haplótipos dos dois polimorfismos ESR1 estudados, através do teste de Kruskal- Wallis, apenas se encontraram diferenças estatisticamente significativas para os genótipos Pvu II relativamente à média do número total de folículos (p=0,031) e uma possível relação com o doseamento de estradiol (p=0,089) (Gráfico 3 e Gráfico 4).

No número médio total de folículos nos diferentes genótipos Pvu II, verificou-se que as pacientes com genótipo CC apresentam um número folicular médio de 11,23±5,52, as CT 12,62±8,09, e as TT, 10,42 ±7,81 (CC vs CT p = 0,615; CC vs TT p= 0,088; CT vs TT p =0,010) (Gráfico 3). Apenas existem diferenças estatisticamente significativas entre o grupo com genótipo CT e o grupo com genótipo TT, verificando- se uma maior produção de folículos no grupo heterozigótico. Entre o grupo com genótipo CC e o grupo com genótipo TT não existem diferenças estatisticamente significativas. Contudo, o valor de p parece revelar que, com aumento do número de

Gráfico 2. Percentagem de ovócitos maduros no grupo

controlo e no grupo experimental. *p=0,078 O valor de p foi obtido através do teste de Mann-Witney.

Percentagem de ovócitos maduros

0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%

Grupo controlo Grupo experimental *

ciclos analisados (n), as diferenças entre o grupo CC e o grupo TT poderiam ser estatisticamente significativas.

Os níveis de estradiol mostraram-se diferentes consoante o genótipo Pvu II apresentado pelas pacientes (Gráfico 4). Os homozigóticos CC apresentaram um valor médio de 2148,7±1464,86 pg/mL, os heterozigóticos CT 1897,87±1380,33 pg/mL e os homozigóticos TT 705,83±1137,73 pg/mL (CC vs CT p= 0,086; CC vs TT p= 0,024; CT vs TT p= 0,476).

Encontraram-se, apenas, diferenças estatisticamente significativas ao comparar os dois grupos homozigóticos. O grupo com genótipo CC produziu uma quantidade média de estradiol consideravelmente maior do que o grupo de genótipo TT. As diferenças entre os grupos CC e CT não são estatisticamente significativas. Contudo, um aumento do número de ciclos analisados (n) poderá tornar as diferenças entre o grupo CC e o grupo CT estatisticamente significativas.

Gráfico 3. Média do número total de folículos no dia da administração de hCG nos três tipos

de genótipos do polimorfismo Pvu II. ap =0,088 bp =0,065 cp =0,010 Os valores de p foiram obtidos através do teste de Kruskal-Wallis.

Média do nº total de foliculos no dia da administração da hCG

0 5 10 15 20 25 CC CT TT Genótip os Pvu II a b c

Seguidamente, procurou-se relacionar os polimorfismos Pvu II e Xba I com as causas de esterilidade. Para além do grupo controlo que possui um factor de esterilidade apenas masculino, foram definidas sete causas de esterilidade feminina: distúrbios da ovulação; endometriose; factor tubário; factor uterino; factor cervical; e factor feminino misto – pacientes com mais do que um factor de esterilidade.

A associação entre as frequências dos alelos, genótipos e haplótipos dos dois polimorfismos analisados com as causas de esterilidade foi efectuada através do teste de X2 e encontra-se na Tabela II.

Apesar de ocorrerem frequências genotípicas distintas entre as várias causas de esterilidade feminina estas não são estatisticamente diferentes das frequências observadas no grupo controlo (ESR1 Pvu II p= 0,647; ESR1 Xba I p=0,926; ESR1 Pvu II / Xba I p=0,961).

Gráfico 4. Doseamento do estradiol no dia da administração da hCG nos três grupos de genótipos

do polimorfismo Pvu II. ap= 0,024 bp= 0,086 cp= 0,476 Os valores de p foram obtidos através do teste de Kruskal-Wallis.

Doseamento do estradiol no dia da administração da hCG

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 CC CT TT Genótipos Pvu II a b c

Tabela II. Frequências de genótipos e haplótipos dos polimorfismos Pvu II e Xba I nas diferentes causas de esterilidade.

Frequências Grupo Controlo Causas de Esterilidade Feminina

Factor masculino Desordens ovulatórias Endometriose Factor tubário Factor uterino Factor cervical Causa inexplicada Factor Feminino Misto

n=12 n=5 n=14 n=20 n=1 n=6 n=3 n=43 ESR1 Pvu II CC 2 (16,7%) 1 (20,0%) 5 (35,7%) 5 (25,0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 6 (14,0%) CT 7 (58,3%) 3 (60,0%) 3 (21,4%) 11 (55,0%) 1 (100%) 4 (66,7%) 2 (66,7%) 27 (62,8%) TT 3 (25,0%) 1 (20,0%) 6 (42,9%) 4 (20,0%) 0 (0%) 2 (33,3%) 1 (33,3%) (10) 23,3% a_p=0,647 C 45,8% 50% 46,4% 52,5% 50% 33,3% 33,3% 45,3% T 54,2% 50% 53,6% 47,5% 50% 66,7% 66,7% 54,7% ESR1 Xba I GG 2 (16,7%) 1 (20,0%) 4 (28,6%) 4 (20,0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 7 (16,3%) GA 9 (75,0%) 4 (80,0%) 8 (57,1%) 12 (60,0%) 1 (100%) 4 (66,7%) 2 (66,7%) 30 (69,8%) AA 1 (8,3%) 0 (0%) 2 (14,3%) 4 (20,0%) 0 (0%) 2 (33,3%) 1 (33,3%) 6 (14,0%) b p=0,926 G 54,2% 60% 57,1% 50% 50% 33,3% 33,3% 51,2% A 45,8% 40% 42,9% 50% 50% 66,7% 66,7% 48,8%

ESR1 Pvu II / Xba I

CCGA 0 (0%) 0 (0%) 2 (14,3%) 1 (5,0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 2 (4,7%) CCGG 2 (16,7%) 1 (20,0%) 3 (21,4%) 4 (20,0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 3 (7,0%) CTAA 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 1 (5,0%) 0(0%) 0 (0%) 0 (0%) 1 (2,3%) CTGA 7 (58,3%) 3 (60,0%) 2 (14,3%) 10 (50,0%) 3 (100%) 4 (66,7%) 2 (66,7%) 23 (53,5%) CTGG 0 (0%) 0 (0%) 1 (7,1%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 3 (7,0%) TTAA 1 (8,3%) 0 (0%) 2 (14,3%) 3 (15,0%) 0 (0%) 2 (33,3%) 1 (33,3%) 6(14,0%) TTGA 2 (16,7%) 1 (20,0%) 4 (28,6%) 1 (5,0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 5 (11,6%) c_{p= 0,961}

Os valores de p foram obtidos através da realização do teste de X2 de Pearson .Os resultados são considerados estatisticamente significativos para valores de p <0,05, o que não se observou nos valores de p apresentados nesta tabela (ap, bp, cp). n – número de pacientes

Finalmente, procurou-se relacionar os polimorfismos Pvu II e Xba I com o tipo de esterilidade. Existem dois tipos de esterilidade a esterilidade primária (I) na qual o casal sem filhos não alcança uma gravidez após um ano de relações sexuais desprotegidas, e a esterilidade secundária (II) em que o casal com pelo menos um filho, por alguma razão, é incapaz de alcançar uma nova gravidez após um ano de relações sexuais desprotegidas.

A associação entre genótipos e haplótipos dos dois polimorfismos analisados com os tipos de esterilidade, realizada através do teste do X2, encontram-se na tabela III. Verificou-se que não existem diferenças estatisticamente significativas entre a distribuição dos genótipos avaliados nas pacientes com esterilidade I e II (ESR1 Pvu II p= 0,363; ESR1 Xba I p=0,074; ESR1 Pvu II / Xba I p=0,300) Contudo, pensa-se que com um aumento do número de casos em estudo (n) poderia haver diferenças estatisticamente significativas entre os genótipos Xba I na esterilidade I e II. A frequência dos genótipos Xba I que incluem o alelo A (GA e AA) são mais elevadas na esterilidade I (69,4% e 17,6 %, respectivamente) do que na esterilidade II (57,1% e 9,5%, respectivamente). Consequentemente, a frequência do genótipo GG é mais elevada na esterilidade II (33,3%) do que na esterilidade I (12,9%). A frequência do alelo A é maior na esterilidade I (52,4%) do que na esterilidade II (38,1%) e a do alelo G é maior na esterilidade II (61,9%) do que na esterilidade I (47,6%).

Tabela III. Frequências de alelos, genótipos e haplótipos dos polimorfismos