Tratamento com MK801 in vivo reduz a fosforilação das MAP quinase ERK 1,2 em esplenócitos totais de animais com EAE

Como nossos resultados in vitro demonstraram uma redução na fosforilação de ERK 1,2 após tratamento com MK801, sendo que o uso do agonista NMDA apresentou resultado oposto, decidimos também avaliar in vivo se a redução nos scores da EAE se correlacionavam com uma redução na fosforilação de ERK. De fato, como demonstra a figura 12, detectamos por western blot uma redução na fosforilação de ERK 1,2 em esplenócitos totais de animais com EAE previamente tratados com MK801. As células foram obtidas ao dia 7 pós-imunização. Por outro lado, não observamos diferença quando avaliadas células totais dos linfonodos drenantes (Figura 12).

Figura 12: Bloqueio do NMDAR in vivo reduz a fosforilação de MAP Quinases ERK-1 e ERK-2 em esplenócitos totais. Esplenócitos totais foram obtidos de animais imunizados para desenvolvimento de EAE, tratados ou não com MK801 (0,3 mg/kG), ao dia 7 pós-imunização. As células foram lisadas e submetidas ao protocolo de western blotting para detecção das proteínas ERK-1, ERK-2, e fosfo- ERK-1 e fosfo-ERK-2. Em A) wesrtern blotting e B) gráfico representativo de leitura densitométrica (Image J® _{- NIH). Dado representativa de um único experimento.}

Linfonodos Ctrl MK801 Baço Ctrl MK801

p-ERK 1

p-ERK 2

U

n

id

a

d

es

A

rb

itr

á

ri

a

s

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5 DISCUSSÃO

Conforme relatado por muitos grupos de pesquisa, células do sistema imune são capazes não somente de expressar uma série de receptores para neurotransmissores [37], como eventualmente secretar os mesmos, dentre eles o glutamato [37,38]. Apesar das evidências de sua presença em células imunes, pouco foi esclarecido a respeito do papel funcional desse receptor nestas células. Através de nossos estudos, obtivemos alguns resultados interessantes acerca da biologia do receptor NMDAR em células do sistema imune. Pudemos observar que, linfócitos T CD4, obtidos ex vivo a partir de camudongos C57Bl/6 e de linhagem DO 11.10, expressam o receptor NMDAR, corroborando a literatura. A imunofluorescência de linfócitos T CD4 ex vivo murinos apresentou reação positiva para o anticorpo anti-NR1 na superfície dessas células, indicando a presença de receptor NMDAR nas mesmas. Em células de linhagem DO 11.10, a análise de resultados para expressão de grin1 nos permitiu observar que o padrão de expressão de NMDAR varia de acordo com o estado funcional da célula avaliada, uma vez que células T naive apresentam expressão diferente de células ativadas com anti-CD3. Tal resultado chama atenção para o fato de que o glutamato pode exercer funções distintas dependendo do estado funcional da célula alvo. Neste contexto, é plausível pensarmos que o glutamato secretado por células dendríticas [38] ou células epiteliais tímicas [37] modula diferencialmente fenômenos moleculares e celulares em células T, dando relevância ao fato de que tanto células naive como células T ativadas infiltram o SNC durante doenças neuroinflamatórias, local com grande concentração de glutamato.

Com relação ao papel do NMDAR em doenças neuroinflamatórias, estudos documentaram a redução de sinais clínicos em animais frente ao uso de antagonistas para esse receptor [42,52,53] e, a partir desses dados, conferiram ao mesmo o papel pró-inflamatório. Apesar do conhecimento sobre o efeito deletério da ativação do receptor NMDAR sobre essas doenças, pouco se elucidou a respeito dos mecanismos imunomodulatórios envolvidos. Através da avaliação da expressão de fatores anti e pró-inflamatórios para identificar o perfil de citocinas envolvido na ativação do receptor NMDAR, observamos que em células DO11.10 ativadas a expressão de IL-2, IL-10, RORc e SOCS-3 diminui após estímulo do NMDA. Inicialmente formulamos a hipótese de que tal efeito fosse resultado de morte celular provocada por aumento dos níveis de cálcio intracelular. No entanto, ensaios porteriores de proliferação e morte celular mediante a diferentes concentrações de NMDA e MK801, demonstraram que a concentração utilizada em laboratório é adequada e que, portanto, os resultados obtidos por PCR para dose de citocinas não é resultado de morte, mas sim efeito de da ativação ou inibição

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do receptor NMDAR. Quanto à expressão de citocinas, foi observada a redução na expressão da citocina anti-inflamatória IL-10 e da molécula supressora SOCS-3 em células DO 11.10 ativadas por anti-CD3 na presença de NMDA. Para a molécula pró-inflamatórias RORc, que corresponde ao gene codificante para o fator nuclear ROR t, o receptor NMDAR demonstrou efeito pró-inflamatório em células naive e efeito oposto em células ativadas. Em células naive, o estímulo com NMDA induziu ao aumento de transcritos RORc, e MK801 resultou em redução das mesmas moléculas. Em células ativadas por anti-CD3, o efeito observado foi oposto, uma vez que o estímulo com NMDA provocou redução da expressão de RORc, ao passo que MK801 resultou em aumento. Sendo assim, aparentemente o receptor NMDAR possui efeito pró- inflamatório sobre linfócitos, uma vez que o estímulo com seu antagonista provoca a redução de marcadores anti-inflamatórios importantes, como IL-10 e SOCS-3. A expressão da molécula pró-inflamatória RORc é influenciada pelo estágio funcional da célula, mas apresenta caráter pró-inflamatório para células naive.

Observamos também que a via de sinalização das MAP quinases ERK-1 e ERK-2, uma via de sinalização bastante relevante e bem caracterizada em linfócitos, está aumentada em células DO11.10 ativadas com NMDA e inibida quando na presença de seu antagonista, MK- 801. Mais interessante, observamos que células naive apresentam maior intensidade de banda para ERK1, ao passo que para células ativadas isso ocorre com a banda de ERK2. Costumeiramente, é adotado que ERK-1 e ERK-2 possuem funções similares na via de MAP quinases. No entanto, por acreditarmos que diferenças sutis na ativação de vias de sinalização podem refletir em diferenças importantes referente à imunomodulação por NMDA, buscamos na literatura explicação para o dado observado. De fato, Harrington et al (2012) observaram que há uma competição de ERK-1 e ERK-2 por Mek, uma MAP quinase, durante a ativação da via de sinalização das MAP quinases [55]. Segundo os autores, ERK-1 demora mais para ser transportada para o núcleo e mantém sua ativação por menos tempo que ERK-2 e, por isso, o sinal necessário para sua ativação deve ser mais intenso para ativação de ERK-2. Sendo assim, ERK1 necessita de ativação celular para ser acionada, ao passo que ERK2 pode ser mobilizada em células naive. Tais dados vão ao encontro daqueles obtidos por nós. Podemos verificar que em células DO11.10, células naive apresentam banda mais intensa para ERK2 ao passo que células ativadas exibem maior intensidade para a banda de ERK1, em ambos os casos após estímulo com NMDA. Muito pouco se sabe a respeito da do papel biológico para a diferença de ativação entre ERK-1 e ERK-2, mesmo porque há poucos relatos a esse respeito. Não podemos afirmar a influência que a diferença na ativação de ERK tem sobre a modulação imune

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por NMDAR, no entanto é um dado interessante e futuramente, quando as diferenças entre ERK1 e ERK2 forem esclarecidas, teremos mais dados a respeito da modulação por NMDAR.

Afim de avaliar a apoptose por células T CD4 mediante os estímulos com NMDA ou MK, conduzimos ensaios de dose-resposta para viabilidade celular e apoptose em diferentes concentrações de NMDA e MK801. Pudemos observar que o estímulo com o antagonista MK801 sozinho reduz a viabilidade celular e provoca apoptose a uma concentração igual ou superior a 500 μM. O estímulo com NMDA a diferentes concentrações demonstra que, mesmo a β00 μM, quantidade superior à que usamos em laboratório, as células T CD4 não apresentam apoptose. No entanto, quando combinamos estímulos de NMDA e MK801 na cultura, verificamos que concentrações crescentes de MK801 resultam em aumento de apoptose. No ensaio de células estimuladas com NMDA e MK801 houve uma discreta redução de células vivas para a quantidade de MK801 utilizada em laboratório, 100 μM, embora a viabilidade tenha se mantido elevada. A quantidade que utilizamos de MK801, está de acordo com a literatura, uma vez que outras equipes de pesquisa também utilizam o antagonista na mesma concentração, 100 μM, para estudo da função de NMDAR em células imunes [37,56]. E, da mesma forma, a concentração de NMDA que utilizamos em cultura também está adequada, uma vez que já foi demonstrado por Mashkina et al (2007) que o uso de uma dose de NMDA 50 vezes superior à utilizada por nosso grupo não compromete a viabilidade desse tipo celular [54]. Sendo assim, podemos afirmar que a quantidade de NMDA e MK801 aplicadas em cultura de células em nosso laboratório são corretas e, portanto, apoptose não é o motivo para a redução de citocinas pró-inflamatórias ou da ativação da via de sinalização de MAP quinases. Podemos concluir que os resultados funcionais obtidos com os estímulos de células T CD4 com NMDA e MK801 é resultante da ação do receptor NMDAR sobre as mesmas.

Como mencionado anteriormente, estudos documentaram a redução de sinais clínicos em animais tratados com antagonistas de NMDAR. De fato, em nosso laboratório, o mesmo foi observado. O tratamento de camundongos imunizados com MOG para indução de EAE com o antagonista MK801 mostrou uma redução relevante dos sinais clínicos e grau de doença nesses animais. Para verificar se a inibição da via de MAP quinases também ocorre em animais na presença de MK801, como foi observado in vitro, conduzimos um ensaio para avaliação da ativação dessa via em células ex vivo de animais imunizados com MOG, tratados ou não com MK801. Os resultados demonstram uma marcante redução das bandas de pERK-1 e pERK-2 em células esplênicas de animais tratados com MK801 em relação às de animais não tratados. Maddahi & Edvinsson demonstraram em 2010 que a inibição da via de MAP quinases por um inibidor da mesma resultou em menor expressão de citocinas pró-inflamatórias importantes em

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doenças neuroinflamatórias (IL-1 , IL-6, TNF-α e iNOS) e reduziu os sinais clínicos de isquemia cerebral [57]. Sendo assim, acreditamos que a redução do quadro de doença em animais com EAE pode estar relacionada à inativação da via de MAP quinases frente à inibição do receptor NMDAR por MK801. Em linfonodos, no entanto, não foi observada diferença de fosforilação de ERK entre animais tratados e não-tratados. É possível que a diferença observada esteja relacionada a diferenças funcionais de células imunes de baço e linfonodo para a via de sinzalização de MAP quinases. Foi demonstrado por Baumgarth et al (1997) que existe diferença na a ativação na via de sinalização da MAP quinase ERK-2 de linfócitos ativados de linfonodos mesentéricos e linfonodos de pulmão [58]. Os autores demonstraram que a proliferação celular decorrente de ativação por TCR e sinalização de ERK-2 vista em pulmão não ocorre em linfonodos mesentéricos, onde a proliferação por ativação de TCR ocorre por sinalização independente de ERK. Embora nossos resultados demonstrem a ativação de MAP quinases em linfonodos, ao invés de inibição como demonstrado por Baumgarth et al, é possível que esta via se encontre ativada por haver uma resposta diferenciada da mesma a estímulos neste local.

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6 CONCLUSÃO

Em resumo, nossos dados apontam para o glutamato, agindo através de seu receptor ionotrópico NMDAR, como um fator imunomodulador importante da resposta imune, aqui avaliada. A partir dos dados obtidos experimentalmente pelo nosso grupo, podemos concluir que:

- Linfócitos T expressam o receptor NMDAR

- Células naive e ativadas apresentam diferença na expressão de NMDAR - NMDAR tem a tendência de atuar como pró-inflamatório em células naive - NMDAR atua sobre a via das MAP quinases em linfócitos T

- Em células naive, NMDA ativa ERK 1 e 2; ao passo que em células ativadas NMDA ativa ERK 2

- A ativação de NMDAR por seu agonista reduz a transcrição gênica e, esta redução não é resultante de morte celular

- Concentrações de MK801 em valores acima de 500 μM induz a morte celular em culturas de células in vitro

- O tratamento com MK801 reduz os sinais clínicos de EAE

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